蛋白电转怎么做？电穿孔参数与递送效果验证

蛋白电转是利用电穿孔技术，将纯化蛋白、重组蛋白或蛋白复合物导入活细胞的一种物理递送方法。在细胞生物学、蛋白功能分析、信号通路研究和基因编辑实验中，研究人员有时需要将已经制备好的蛋白质直接送入细胞，而不是先导入DNA或mRNA，再由细胞表达目标蛋白。

实际实验中，研究人员经常遇到几个问题：蛋白质可以直接使用电穿孔仪导入细胞吗？蛋白电转需要多少电压？为什么已经检测到荧光蛋白信号，却不能确定蛋白真正进入了细胞内部？为什么部分蛋白能够成功递送，却无法发挥预期的生物学作用？

蛋白电转与常规质粒DNA转染存在明显区别。蛋白质除了需要进入细胞，还需要在递送过程中尽可能保持适当的结构、活性及亚细胞定位。

因此，蛋白电转的评价指标不能只有荧光阳性率，还应包括细胞活率、实际胞内蛋白含量及目标蛋白功能。

本文结合公开研究，介绍蛋白电穿孔的基本原理、参考实验条件、参数影响因素、递送效果验证及电穿孔仪选型方法。

一、蛋白电转是什么？与DNA、mRNA电转有什么区别？

蛋白电转通常是指通过电脉冲改变细胞膜通透性，使外源蛋白质能够进入目标细胞。

与质粒DNA或mRNA电转不同，蛋白电转递送的是已经存在的蛋白分子，不需要依赖细胞首先完成目标蛋白的转录和翻译。

这种方式适用于部分需要直接研究蛋白结构、亚细胞定位、蛋白相互作用或短期功能的实验。

需要注意，电转后在细胞内检测到外源蛋白，不代表其一定具有完整的生物学活性。

部分蛋白可能在制备、混合、电刺激或恢复培养过程中发生聚集、降解或构象变化，进而影响最终实验结果。

二、电穿孔为什么能够递送蛋白质？

细胞膜能够限制许多外源大分子直接进入细胞。蛋白质通常具有一定分子体积，其电荷状态、空间结构及溶液环境也会影响膜转运过程。

电穿孔通过外加电脉冲，使细胞膜通透性发生短暂变化，为蛋白质等外源分子进入细胞创造条件。

在适当条件下，部分细胞能够在脉冲结束后恢复膜完整性，并继续培养。

但电穿孔并非保证所有蛋白进入细胞的通用方法。

对于不同分子量、不同电荷状态和不同结构的蛋白，其实际递送表现可能存在差异。

部分蛋白即使能够进入细胞，也可能因为聚集或错误定位，无法参与预期的细胞内反应。

因此，蛋白电转成功需要同时满足两个条件：蛋白进入合适的细胞内位置，以及递送后仍然具有研究所需的功能。

三、蛋白电转主要应用于哪些实验？

1. GFP等荧光蛋白递送

绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）是蛋白递送研究中常见的模型分子之一。

通过将纯化GFP直接导入细胞，可以利用适当的荧光成像方法观察蛋白进入细胞后的信号。

与GFP质粒转染不同，直接导入纯化GFP时，检测到的荧光主要来自已经存在的外源蛋白，而不是细胞新表达的GFP。

2. 重组蛋白功能研究

对于已经在体外完成表达和纯化的重组蛋白，可以根据蛋白性质及研究目的，评估通过电穿孔直接导入活细胞的可行性。

例如，研究人员可能需要观察外源蛋白在细胞内的定位，或者分析其与细胞内其他蛋白之间的相互作用。

这种方式能够在部分实验中减少细胞内异源表达过程带来的影响，但仍需要确认蛋白纯度和实际功能。

3. 酶及蛋白复合物递送

部分研究采用电穿孔递送具有酶学活性的蛋白或多亚基蛋白复合物。

对于这类实验，仅检测到蛋白进入细胞是不够的，还需要进一步确认酶活性、复合物完整性及细胞内功能。

4. 抗体及其他蛋白研究

部分研究还探索通过电穿孔等技术，将抗体或其他具有特定结合能力的蛋白递送至细胞内部。

但不同抗体及蛋白在细胞内的稳定性、定位与活性可能不同，必须分别验证。

5. Cas9蛋白及RNP递送

Cas9核酸酶蛋白也可以作为相关蛋白递送研究的对象。

需要注意，常见的Cas9 RNP是Cas9蛋白与向导RNA形成的复合物，并不属于单独的纯蛋白递送。

如果实验目的是CRISPR基因编辑，最终需要通过靶位点检测确认编辑结果，不能仅凭Cas9蛋白进入细胞判断成功。

四、公开研究证明蛋白可以通过电穿孔进入细胞吗？

已有多项公开研究对蛋白直接电穿孔递送进行了实验验证。

1. 2015年：纯化GFP直接递送至哺乳动物细胞

2015年发表于《Journal of Visualized Experiments》的研究《Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells》，介绍了通过电穿孔将纯化蛋白递送至哺乳动物细胞的方法。

研究人员首先利用GFP开展验证实验。

在其特定实验体系中，研究人员使用25 μg/mL纯化GFP，比较了直接与细胞共同孵育以及经过电穿孔处理后的结果。

研究报告，在HeLa细胞及RAW264.7小鼠巨噬细胞样细胞中，经过电穿孔处理的样品可以检测到胞内GFP荧光信号，而单纯共同孵育对照没有获得相同的胞内递送结果。

这一结果为纯化蛋白通过电穿孔进入哺乳动物细胞提供了直接实验依据。

注意：25 μg/mL是该研究的GFP实验条件，并不属于所有蛋白的推荐浓度，也不是威尼德设备的蛋白电转参数。

2. 2019年：重组蛋白递送后的定位和功能验证

2019年发表于《eLife》的研究《Electroporated recombinant proteins as tools for in vivo functional complementation, imaging and chemical biology》，系统分析了通过电穿孔向哺乳动物细胞递送重组蛋白及多亚基蛋白复合物的可行性。

研究使用HeLa等多种细胞，并分析了外源重组蛋白的胞内定位、细胞活率及生物学功能。

其中，研究人员将重组Ndc80、Mis12等蛋白复合物递送至细胞内，并通过相应实验确认部分蛋白能够定位于预期的细胞结构，与内源蛋白相互作用或发挥功能。

这说明，对于部分经过适当制备的重组蛋白，电穿孔不仅能够完成递送，还可以保留研究所需的功能。

但是，研究也指出，部分蛋白因聚集或定位异常而不适合直接采用相同递送条件。

3. 2021年：控制纯化蛋白的胞内递送数量

2021年发表于《STAR Protocols》的研究《Delivering defined amounts of purified protein with high precision into living cells》，提供了使用电穿孔向CAD细胞递送纯化蛋白的实验方法。

研究强调，在对应实验条件下，可以通过改变电转反应体系中的蛋白浓度，调节进入细胞的蛋白数量，并进一步评价细胞功能。

这为研究不同胞内蛋白水平与细胞表型之间的关系提供了实验思路。

但该研究是在特定细胞和设备条件下完成，不能将其结果直接推广至所有蛋白、所有细胞和全部电穿孔设备。

五、公开研究中的蛋白电转参数是多少？

蛋白电转没有适用于全部蛋白和细胞的固定电压。

在2019年eLife研究中，研究人员使用Thermo Fisher Neon系统，针对不同细胞采用了不同电脉冲设置。

研究进一步发现，对于部分细胞，较强的电刺激条件可能伴随细胞存活率下降。

需要注意，研究比较的不同条件同时涉及电压和脉冲持续时间变化，因此不能简单把所有细胞损伤变化归因于电压这一个因素。

特别说明：800 V和1000 V属于Neon专用移液枪头式电转体系的研究条件，不能直接复制到传统电转杯，也不属于威尼德Gene Pulser 830或Gene Pulser X2的推荐参数。

如果实验室使用其他设备，应优先检查设备波形、脉冲时间、电极结构、缓冲液及细胞类型是否具有可比性。

六、影响蛋白电转效率的主要因素有哪些？

1. 蛋白纯度与稳定性

对于纯化蛋白电转，材料质量直接关系到递送结果。

如果蛋白样品已经出现明显聚集、沉淀或降解，即使电转设备正常放电，也可能无法获得预期胞内功能。

实验人员应根据蛋白本身的性质，确认其制备质量、储存条件和必要的活性检测结果。

2. 电转缓冲液的兼容性

部分蛋白储存缓冲液含有一定浓度的盐、甘油或其他添加成分。

这些成分可能影响电转体系的导电性、蛋白稳定性或细胞耐受性。

因此，不能在未核对兼容性的情况下，将高浓度蛋白储存液直接大量加入电转体系。

如果更换缓冲液，还应确认这一过程不会造成目标蛋白失活或聚集。

3. 细胞状态和恢复能力

蛋白电转前的细胞活率、培养状态和样品处理过程，会影响最终递送结果。

对于原代细胞和部分难转染细胞，电转后能够回收多少存活细胞，通常是重要的实验指标。

4. 蛋白分子特性

蛋白大小、电荷、构象及是否形成复合物，都可能影响其在不同电转体系中的表现。

不能认为在一种设备上成功递送GFP，就意味着相同条件也能用于所有酶、抗体或多亚基蛋白复合物。

七、如何判断蛋白真正进入了细胞内部？

这是蛋白电转研究中需要重点解决的问题。

因为电转后检测到荧光信号，并不一定能够直接证明全部外源蛋白已经进入细胞质。

部分蛋白可能仍然附着于细胞表面，或者存在于细胞外残留溶液中。

1. 荧光显微镜观察

如果使用GFP或其他荧光标记蛋白，可以通过适当的显微成像技术观察蛋白信号及其细胞内分布。

必要时，可结合细胞膜或细胞核标记，帮助判断荧光信号所在的位置。

2. 流式细胞术

流式细胞术可以用于分析细胞群体中的荧光阳性比例及荧光强度。

但对于可能存在细胞表面吸附的蛋白，需要采用适当的实验对照和样品处理方式，避免将胞外或膜表面残留信号误判为成功的胞内递送。

3. Western blot等蛋白检测

可以在合适条件下，通过蛋白检测方法分析细胞样品中的目标蛋白。

需要注意，如果没有充分控制胞外蛋白残留，细胞裂解液中检测到目标蛋白，也可能受到非胞内来源的影响。

4. 细胞内定位验证

对于具有特定作用位置的蛋白，需要结合实验目标分析其是否进入了正确的细胞区域。

例如，某些蛋白需要进入细胞核才能发挥作用；某些蛋白则需要定位于细胞膜或特定细胞器。

5. 功能性验证

如果递送的是酶，可以根据实验目标检测相关酶活性；如果递送的是信号蛋白，则应分析其是否引起预期的细胞反应。

对于Cas9 RNP，则需要通过目标位点检测确认编辑结果。

只有胞内递送证据和功能验证相互支持，才能更充分地判断蛋白电转是否达到研究目的。

八、蛋白电转应该设置哪些对照组？

如果蛋白具有特定酶学活性或结合功能，还应根据研究目的考虑相应的功能阴性对照。

例如，研究人员可能需要比较具有完整活性的蛋白和失去关键功能的蛋白，帮助判断观察到的细胞反应是否来自目标蛋白本身。

具体对照应根据蛋白类型和实验目标合理设计。

九、蛋白电转后，应该怎样评价实验结果？

蛋白电转结果建议从递送、活率、胞内蛋白水平和蛋白功能四个层面进行评价。

如果某组电转条件能够获得较高荧光信号，但造成大量细胞死亡，可能不适合需要继续培养的功能研究。

如果细胞活率较高，但目标蛋白没有发挥预期作用，则需要进一步排查蛋白活性、聚集、递送位置及实验检测方法。

十、蛋白电转效率低或细胞死亡多，如何排查？

出现异常时，建议先确认蛋白制备质量和实际细胞状态，再判断是否需要调整脉冲条件。

如果蛋白进入细胞以后出现聚集或失活，单纯提高电压并不能解决这一问题。

十一、蛋白电转实验如何选择电穿孔仪？

如果实验室计划开展纯化蛋白、重组蛋白及蛋白复合物的细胞内递送，应重点考察设备的输出波形、脉冲参数调节范围、实际波形显示以及细胞耗材适配能力。

同时，应明确设备具有相关的外源分子递送功能，不代表已经对所有蛋白类型完成独立实验验证。

1. Gene Pulser 830方波电穿孔仪

威尼德Gene Pulser 830采用方波输出方式，面向哺乳动物细胞、悬浮细胞及原代细胞等研究应用。

根据威尼德官方产品资料，该设备明确将蛋白质列为可评估的外源分子递送类型，并支持独立设置脉冲时间、间隔及次数等参数。

设备还具备实际波形显示、预脉冲电阻测量、实验程序保存及历史记录查询功能。

对于计划进行蛋白电转参数探索的实验室，可以结合目标蛋白、细胞类型、缓冲液及已有可靠研究，评估其方波控制能力是否符合实验需求。

产品详情：Gene Pulser 830方波电穿孔仪。

2. Gene Pulser X2双波电穿孔仪

Gene Pulser X2集成方波与指数衰减波两种输出方式，面向同时开展哺乳动物细胞转染和微生物电转化的实验室。

根据威尼德官网资料，该设备具备实际波形监测、预脉冲电阻检测及程序设置等功能。

如果实验室除蛋白或其他大分子递送研究外，还需要承担细菌、酵母等微生物电转化任务，可以结合设备规格评估双波系统。

产品详情：Gene Pulser X2双波电穿孔仪。

产品适用性说明：威尼德官网能够证明上述设备具备相关波形及外源分子递送的应用描述，但本文没有引用Gene Pulser 830或Gene Pulser X2针对某种纯化蛋白的独立递送效率、蛋白活性及细胞活率实测数据。

因此，不能将第三方研究中的GFP、重组蛋白或多亚基蛋白复合物递送结果归属于威尼德设备，也不能直接照搬Neon等其他品牌的专用电转参数。

十二、蛋白电转常见问题

1. 蛋白质可以直接使用电穿孔仪导入细胞吗？

可以。已有公开研究利用电穿孔将纯化GFP、重组蛋白及部分蛋白复合物导入哺乳动物细胞，并进行了胞内递送和功能验证。但是否适用于具体蛋白，仍需实验确认。

2. 蛋白电转一般需要多少伏？

不存在适用于全部蛋白和设备的固定电压。应根据细胞、蛋白性质、设备波形、电极结构、脉冲时间和缓冲液等完整条件判断。

3. 蛋白电转一定需要方波吗？

不能仅凭递送材料属于蛋白质，就认定必须使用某一种波形。应优先参考与当前细胞、设备和蛋白体系具有可比性的实验资料。

4. 蛋白电转与GFP质粒转染有什么区别？

蛋白电转可以直接递送已经纯化的GFP蛋白；GFP质粒转染则需要细胞表达GFP。两者的递送材料和后续生物学过程不同。

5. 蛋白分子量越大，电转效率就一定越低吗？

不能这样简单判断。蛋白大小是影响因素之一，但电荷、构象、聚集状态、细胞类型和电转体系也可能影响结果。

6. 蛋白电转以后，细胞内检测到荧光就代表成功了吗？

不一定。需要排除细胞表面吸附和胞外残留，并根据实验目的进一步确认蛋白定位和功能。

7. 蛋白电转会直接改变细胞基因组吗？

普通蛋白递送本身不等于基因组编辑。但如果递送的是Cas9等具有相应核酸酶活性的编辑组分，并满足必要的作用条件，后续可能产生基因组变化。

8. 蛋白电转后细胞死亡多，是不是电压太高？

有这种可能，但不能直接确定。还应检查细胞原有状态、缓冲液、蛋白储存液、样品导电性和完整脉冲条件。

9. 电穿孔仪可以保证蛋白递送以后仍然有活性吗？

不能。蛋白活性还取决于蛋白自身质量、处理条件、胞内环境和定位情况。需要通过适当功能实验验证。

十三、蛋白电转设备与实验需求咨询

对于正在开展GFP、重组蛋白、酶及蛋白复合物递送研究的实验室，设备选型应首先明确目标蛋白和细胞类型。

如果实验室正在评估蛋白直接电转方法，建议在咨询设备时提供以下信息：

• 目标细胞名称、来源及培养状态；

• 计划递送的蛋白种类与大致分子量；

• 蛋白的纯化方式、储存缓冲液及已知活性；

• 实验目的是蛋白定位、酶活性还是其他功能研究；

• 当前使用的设备、波形及电转耗材；

• 已参考的公开实验条件与现有检测方法；

• 目前面临的是胞内递送不足、细胞死亡还是蛋白失活问题。

威尼德生物科技（北京）有限公司提供方波及双波电穿孔仪，可围绕目标细胞、外源分子类型、脉冲参数设置及耗材适配等需求进行技术沟通。

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联系电话：15532415159

十四、参考资料与图片来源

1. Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments, 2015.查看纯化GFP及蛋白电转研究。

2. Alex A, et al. Electroporated recombinant proteins as tools for in vivo functional complementation, imaging and chemical biology. eLife, 2019.查看重组蛋白及蛋白复合物电转研究。

3. Skruber K, Read TA, Vitriol EA. Delivering defined amounts of purified protein with high precision into living cells. STAR Protocols, 2021.查看纯化蛋白定量递送研究。

4. Cellular Delivery of Large Functional Proteins and Protein-Nucleic Acid Constructs via Localized Electroporation. 2023.查看大型功能蛋白及局部电穿孔研究。该研究采用纳米通道局部电穿孔平台，结果不能直接推广至普通电转杯设备。

5. 威尼德生物：Gene Pulser 830方波电穿孔仪技术资料。

6. 威尼德生物：Gene Pulser X2双波电穿孔仪技术资料。

7. 图1：Richard Wheeler（Zephyris），Electroporation Diagram，Wikimedia Commons。查看原图；CC BY-SA 3.0授权。图片未修改。

8. 图2：Raymond Keller，Gfp and fluorophore，Wikimedia Commons。查看原图及公共领域声明。图片未修改。

9. 图3、图4：威尼德生物官方网站Gene Pulser 830和Gene Pulser X2产品实物图。

技术说明：本文介绍蛋白质电穿孔递送的研究原理、公开实验条件、主要影响因素及效果评价方法。第三方研究参数及蛋白递送结果不属于威尼德设备独立实测数据，不能直接作为其他品牌电穿孔仪的推荐程序。不同蛋白、细胞及设备之间可能存在差异，具体应用应依据可靠资料及实际验证确定。本文仅用于科研技术交流。