难转染细胞电转怎么做？效率、活率与参数优化

在分子生物学、免疫学、细胞工程和基因编辑研究中，研究人员经常需要将质粒DNA、mRNA、siRNA或CRISPR相关分子导入目标细胞。然而，并不是所有细胞都能通过常规转染方法获得理想结果。

例如，原代T细胞、NK细胞、部分单核细胞、树突状细胞及干细胞，在特定实验条件下可能表现出转染效率低、细胞死亡较多或实验结果重复性差等问题。这些细胞通常被归入需要重点优化递送条件的难转染细胞（Difficult-to-Transfect Cells）。

实际实验中，研究人员经常遇到以下问题：难转染细胞为什么转染效率低？脂质体转染效果不好，是否应该更换为电穿孔？电转电压应该设置多少？为什么转染阳性率提高了，最终能够回收的存活细胞却减少了？

这些问题需要结合细胞特性、递送材料、实验方法和检测指标分别分析，不能简单归因于电压不足或设备性能问题。

本文结合公开研究，介绍难转染细胞的常见类型、转染困难的原因、电穿孔技术的适用条件、参数优化方法，以及如何选择满足实际实验需求的电穿孔仪。

一、什么是难转染细胞？

难转染细胞并不是一个具有严格统一边界的细胞分类，而是实验人员对某些细胞在特定递送条件下难以获得理想结果的描述。

例如，某一种细胞使用脂质体转染时效率较低，但通过经过验证的电穿孔条件可能获得更好的递送效果。另一种细胞可能容易检测到外源核酸信号，却在转染后出现明显死亡，导致后续实验无法完成。

因此，判断细胞是否“难转染”，必须说明采用什么递送方法、导入什么材料，以及需要达到什么实验结果。

1. 常见难转染细胞及研究场景

需要注意，表中列出的细胞并不意味着在所有条件下都难以转染。例如，某些细胞系已经具有成熟的转染方法，实际实验困难程度可能因试剂和操作体系而明显不同。

二、为什么部分细胞难以转染？

造成细胞转染困难的原因可能涉及细胞膜、核酸递送、细胞状态及后续表达等多个方面。

1. 常规转染试剂与细胞不匹配

脂质体等化学转染方法需要外源分子以适当形式与细胞相互作用，并完成进入细胞及后续胞内转运过程。

不同细胞对转染试剂的反应可能不同，因此某一种试剂在HEK293细胞中能够获得理想效果，并不代表在原代T细胞或NK细胞中也具有相同表现。

对于部分原代免疫细胞，常规脂质体转染可能效率不足，或者产生无法满足后续实验要求的细胞损伤。

2. 细胞本身对处理条件较为敏感

原代细胞通常具有特定的培养和生理状态。部分细胞在分离、消化、离心或重新悬浮以后，可能已经受到一定程度的应激。

如果随后进行电穿孔或其他转染处理，细胞可能进一步受到影响，最终表现为活率下降。

3. 导入材料不同

质粒DNA、mRNA、siRNA和Cas9 RNP等材料，在分子结构、作用位置及实验目的方面存在差异。

例如，普通质粒DNA要完成核内表达，而mRNA可以在细胞质中参与翻译。Cas9 RNP则需要达到相应作用位置并完成目标位点编辑。

因此，即使细胞类型相同，改变递送材料以后，原有转染条件也不一定继续适用。

4. 电转后的恢复能力不足

有些实验并不是没有发生递送，而是电转后细胞死亡较多，导致最终能够检测和使用的细胞数量偏低。

对于原代细胞、干细胞及其他珍贵样品，细胞恢复能力往往是评价电转方案的重要因素。

5. 检测方法不能反映最终实验目标

例如，使用荧光标记siRNA检测到阳性信号，不一定说明目标基因已经成功敲低。

同样，Cas9 RNP进入细胞也不意味着目标位点已经发生预期编辑。

如果把递送信号与真正的功能结果混为一谈，就可能误判实验问题，进一步导致不必要的参数修改。

三、难转染细胞应该选择脂质体还是电穿孔？

脂质体转染和电穿孔都是常见的非病毒递送方式，但两者的工作机制不同。

脂质体转染依赖脂质类载体与核酸等材料形成适当的递送体系；电穿孔则主要通过外加电脉冲改变细胞膜的通透性。

对于已经能够使用脂质体实现可靠转染的细胞，不一定需要更换为电穿孔。

但是，如果目标细胞在经过合理试剂优化以后仍然难以获得足够的功能性递送，或者需要直接递送某些蛋白及RNA复合物，可以进一步评估电穿孔方案。

选择原则：比较两种方法时，应以相同的目标细胞和研究任务为基础，综合评价最终实验效果，而不是只比较不同论文报告的最高阳性率。

四、公开研究中的难转染细胞电转效果如何？

1. 2008年原代细胞与难转染细胞研究

2008年发表于《Journal of Biomolecular Techniques》的研究《Optimizing Electroporation Conditions in Primary and Other Difficult-to-Transfect Cells》，系统分析了多种原代细胞及难转染细胞的电穿孔条件。

研究使用Bio-Rad Gene Pulser MXcell电转系统，对人原代成纤维细胞、HUVEC、Jurkat及神经母细胞瘤细胞系等样品开展质粒DNA和siRNA递送研究。

其中，研究人员使用荧光标记的转染对照siRNA，并通过流式细胞术评价相应信号。

数据解释：这些数值来自Bio-Rad Gene Pulser MXcell研究中，对荧光标记siRNA进行的流式检测，不能直接等同于目标基因敲低效率，也不是威尼德设备的转染效率实测结果。

该研究还说明，细胞状态、核酸类型、电场条件及缓冲体系，都可能影响实际递送效果。

2. 2018年干细胞和原代T细胞研究

2018年发表于《Scientific Reports》的研究《Efficient homology-directed gene editing by CRISPR/Cas9 in human stem and primary cells using tube electroporation》，采用特定的管式电穿孔平台，对人iPSC、原代T细胞及间充质干细胞进行了递送和基因编辑研究。

研究表明，在其特定实验体系中，不同细胞可以通过电穿孔获得核酸、蛋白或CRISPR相关组分的递送。

其中，研究人员还进一步分析了人iPSC的同源定向修复，以及原代T细胞和间充质干细胞中的目标基因编辑结果。

这说明，部分难转染细胞具有电穿孔递送的研究依据，但不同研究平台之间的设备结构、缓冲体系和输出参数可能不同。

不能把管式电穿孔平台的研究参数直接当作传统电转杯设备的推荐程序，也不能据此认定所有难转染细胞都能获得相同效果。

五、难转染细胞电转参数应该如何选择？

难转染细胞电转没有适用于全部细胞和递送材料的统一参数。

对于传统电转杯系统，电压、波形、脉冲时间及电转杯间距，都可能影响细胞实际受到的电脉冲作用。

1. 电压与电极间距

在传统电转杯体系中，名义电场强度可以通过以下关系理解：

电场强度E＝施加电压V÷电极间距d。

因此，使用相同电压并不代表使用不同电转杯时获得相同的电场条件。

但实际电转结果还受到脉冲形态、样品负载和缓冲体系影响，不能只根据名义电场强度判断参数是否合适。

2. 电转波形

常见电穿孔设备采用方波或指数衰减波等输出方式。

方波能够按照设备支持的设置控制脉冲时间和次数；指数衰减波则具有相应的放电衰减过程。

对于原代细胞及其他难转染样品，公开研究中存在不同波形的电穿孔方案。

因此，不能认为所有难转染细胞都必须使用某一种波形。应优先参考与目标细胞及具体设备匹配的实验资料。

3. 脉冲时间与次数

脉冲时间和次数影响细胞接受的电刺激过程。

如果某种条件能够提高递送信号，但同时造成明显的细胞损伤，就需要重新评价其是否满足后续研究需求。

对于珍贵的原代细胞，应避免在缺乏参考依据的情况下大范围、反复尝试高强度电脉冲。

4. 电转缓冲液

电转缓冲液的组成可能影响溶液导电性、细胞状态及实际放电结果。

不同设备和细胞可能需要不同的缓冲体系。

因此，其他品牌的专用缓冲液及电转程序不能未经验证地直接替换。

5. 细胞数量与核酸类型

电转前的活细胞数量、细胞密度，以及实际导入的DNA、mRNA、siRNA或RNP类型，都可能影响实验结果。

例如，同一种细胞在质粒DNA和mRNA递送实验中的参数需求可能存在差异，不应默认使用同一套设置。

6. 电转后恢复条件

对于部分原代细胞和干细胞，电转后恢复与培养条件可能直接影响最终可用细胞数量。

因此，参数优化需要将恢复条件纳入实验设计，而不是只观察放电后短时间内的荧光信号。

六、难转染细胞电转效率低，应该先排查什么？

实验结果不理想时，应先区分以下三种情况。

情况一：递送信号本身很低

例如，经过适当检测以后，仍然无法确认足够的外源核酸或报告基因进入目标细胞。

此时应重点检查：

• 细胞是否处于适合实验的状态；

• 递送材料质量及实际加入量；

• 设备是否正常完成预期脉冲；

• 电转杯和缓冲液是否与实验方案匹配；

• 是否存在经过验证的递送阳性对照；

• 检测时间和检测方法是否适合目标材料。

如果递送阳性对照也没有获得正常结果，应优先检查基础实验体系，而不是直接提高电压。

情况二：递送阳性率较高，但细胞大量死亡

这种情况说明仅仅提高递送比例，可能无法满足后续研究需要。

应进一步检查脉冲条件、细胞原有状态、缓冲体系及电转后恢复过程。

对于原代免疫细胞和干细胞，应特别关注实际存活细胞数量。

情况三：递送成功，但没有达到预期功能

例如，荧光标记siRNA呈阳性，但目标mRNA没有明显下降；或者Cas9 RNP已经递送，但没有检测到预期的目标位点编辑。

此时问题可能发生在递送之后。

实验人员应重点检查目标序列、递送材料的功能活性、表达过程或相应基因编辑验证方法，而不是直接把问题归因于电穿孔仪。

七、难转染细胞电转，为什么不能只看阳性率？

对于样品数量有限的原代细胞，实验真正需要的通常不是最高的阳性百分比，而是能够继续用于研究的有效阳性活细胞。

假设某实验室使用相同起始数量的细胞，比较两组经过验证的电转条件：

在这个示例中，A组具有更高的阳性比例，但B组最终获得的阳性活细胞数量更多。

如果实验需要继续培养、分选或开展细胞功能研究，B组可能具有更高的实际价值。

需要注意，以上数字仅用于说明评价方法，不属于威尼德设备或特定细胞的实测数据。

阳性活细胞数量＝回收活细胞数量×活细胞群体内的阳性比例。

此外，还应结合目标基因表达、编辑结果及细胞后续功能，判断电转方案是否真正满足研究目的。

八、如何建立可重复的难转染细胞电转方案？

第一步：明确细胞类型及实验目标

确认使用原代T细胞、NK细胞、HUVEC、Jurkat还是其他细胞，并明确是导入质粒、mRNA、siRNA或Cas9 RNP。

第二步：寻找具有可比性的实验依据

优先查找与目标细胞、递送材料、设备平台和缓冲体系相近的公开研究。

如果参考文献采用其他品牌的专用电转程序，应先确认程序是否具有可比性，不能仅凭一个电压数字直接转换。

第三步：检查细胞及材料质量

记录电转前活率、细胞数量、培养状态和递送材料质量。

如果细胞原有状态不佳，应优先解决样品问题，再比较电脉冲参数。

第四步：设置适当对照实验

根据研究目标，设置未经电转的细胞对照、无载荷电转对照及经过验证的递送阳性对照。

对于siRNA敲低及CRISPR编辑实验，还需要根据研究设计增加相应的功能性对照。

第五步：比较递送、活率和功能

每组条件至少应关注递送结果、活细胞回收量及研究目的对应的功能指标。

如果参数变化导致阳性率提高，却使最终可用细胞明显减少，需要重新评价该条件。

第六步：保留实验记录并重复验证

建议记录设备型号、波形、实际脉冲、缓冲体系、细胞数量、递送材料及检测结果。

在获得较合适的条件后，应根据实验目的进行重复验证，避免仅凭单次实验判断参数已经稳定。

有关原代细胞为什么不能直接照搬普通细胞系参数，可进一步阅读：原代细胞、免疫细胞电转参数优化：为什么不能照搬普通细胞系？

九、难转染细胞应该选择什么电穿孔仪？

对于主要开展哺乳动物细胞、悬浮细胞及原代细胞转染的实验室，电穿孔仪选型应优先关注输出波形、脉冲参数调节能力、电转耗材及实际放电记录。

如果实验涉及多种珍贵细胞，还应考虑设备是否便于保存不同实验方案、比较参数和记录实际输出。

但需要明确，设备功能适合细胞转染研究，不代表已经针对全部难转染细胞获得独立的效率验证结果。

1. Gene Pulser 830方波电穿孔仪

威尼德Gene Pulser 830采用方波输出方式，官方产品资料将哺乳动物细胞、悬浮细胞、原代细胞及干细胞列为主要研究对象。

设备支持脉冲时间、间隔和次数设置，并具有实际波形显示、预脉冲电阻测量、实验程序保存及历史记录查询功能。

对于以细胞转染为主要任务，需要在有研究依据的范围内比较方波参数的实验室，可以结合设备的具体技术规格进行评估。

对于经常开展原代细胞研究的实验室，上述功能可以辅助保存参数及比较实际输出，但最终递送和细胞活率仍需通过实验验证。

设备详情：Gene Pulser 830方波电穿孔仪。

2. Gene Pulser X2双波电穿孔仪

对于实验方向较多、同时开展哺乳动物细胞转染与细菌、酵母等微生物电转化的实验室，可以评估Gene Pulser X2双波电穿孔仪。

该设备集成方波和指数衰减波输出，官方资料列出了24种常见细胞或微生物参考预设程序，并具有实际波形监测、预脉冲电阻检测及电弧保护功能。

但预设程序并不等于针对全部原代T细胞、NK细胞、iPSC或其他难转染细胞的独立实测方案。

设备详情：Gene Pulser X2双波电穿孔仪。

3. Gene Pulser 830和X2应该怎样选择？

产品适用性说明：威尼德官网可以支持上述设备具有相关波形及参数设置功能，但本文没有使用Gene Pulser 830或Gene Pulser X2针对原代NK细胞、iPSC等特定难转染细胞的独立转染效率和细胞活率实测数据。

因此，不能将第三方研究中的递送效率直接作为威尼德产品性能，也不能将其他设备的专用程序直接作为威尼德推荐参数。

十、难转染细胞电转常见问题

1. 哪些细胞属于难转染细胞？

原代T细胞、NK细胞、部分单核细胞、树突状细胞、干细胞及某些细胞系，在特定递送条件下可能表现出较高的转染难度。但具体困难程度取决于细胞、材料和实验方法。

2. 难转染细胞一定要使用电穿孔吗？

不一定。如果经过验证的化学转染方法已经能够满足研究目标，就不必仅因为细胞被称为“难转染细胞”而更换技术路线。

3. 难转染细胞电转一般需要多少伏？

没有统一电压。应结合细胞类型、电极间距、波形、脉冲时间、缓冲液及可靠的实验资料确定条件。

4. 难转染细胞电转的效率一定比脂质体高吗？

不能保证。电穿孔在部分难转染细胞中具有公开研究依据，但是否获得更高递送效率及更多可用细胞，需要通过具有可比性的实验判断。

5. 为什么电转阳性率提高了，细胞反而大量死亡？

部分条件可能在提高递送信号的同时增加细胞损伤。应进一步检查完整脉冲条件、细胞状态、缓冲液及电转后恢复过程。

6. Jurkat细胞电转参数能直接用于原代T细胞吗？

不建议。Jurkat属于长期培养的T细胞系，而原代T细胞存在供体和激活状态等差异，应根据实际细胞重新验证。

7. PBMC的电转阳性率可以代表NK细胞电转效率吗？

不能直接代表。PBMC包含多种免疫细胞，应该根据研究目标分别分析相应细胞亚群的结果。

8. 电穿孔仪支持原代细胞，就代表能够获得较高转染效率吗？

不代表。设备具备相应电学功能，只是开展实验的条件之一。实际递送效果还取决于细胞、材料、缓冲液和完整实验方案。

9. 难转染细胞电转失败，是否需要立即更换设备？

不一定。应先根据实验对照检查细胞状态、递送材料、缓冲体系和实际输出。如果合适的样品与耗材仍持续出现设备异常，再联系厂家进行检查。

十一、难转染细胞电转设备与实验需求咨询

对于正在开展原代T细胞、NK细胞、PBMC、HUVEC、干细胞及其他难转染细胞研究的实验室，选择电穿孔仪之前，应先明确当前真正需要解决的问题。

例如，实验室可能希望提高递送阳性率，也可能更需要减少细胞死亡、增加可用细胞回收量，或者改善不同批次实验的重复性。

如果需要评估电穿孔设备和相关脉冲功能，建议提前整理以下信息：

• 目标细胞名称、来源及培养状态；

• 目前采用脂质体、电穿孔还是其他递送方法；

• 递送材料是质粒DNA、mRNA、siRNA还是RNP；

• 当前递送阳性率及检测方式；

• 电转前细胞活率及电转后活细胞回收量；

• 已有的设备型号、波形、电转杯及完整参数；

• 目前主要问题是效率低、死亡多还是结果不稳定；

• 是否需要继续培养、基因编辑或开展功能研究。

威尼德生物科技（北京）有限公司提供方波及双波电穿孔仪，可结合实验室的具体细胞、波形需求、参数设置和耗材适配情况进行技术沟通。

产品中心：查看电穿孔仪型号与技术参数

设备选型参考：基因导入仪怎么选？DNA、mRNA与RNP递送设备指南

在线咨询：提交难转染细胞实验与设备咨询需求

联系电话：15532415159

十二、参考资料与图片来源

1. Stewart MP, Langer R, Jensen KF. Intracellular Delivery by Membrane Disruption: Mechanisms, Strategies, and Concepts. Chemical Reviews, 2018.查看难转染细胞与细胞内递送综述。

2. Optimizing Electroporation Conditions in Primary and Other Difficult-to-Transfect Cells. Journal of Biomolecular Techniques, 2008.查看原代细胞及难转染细胞电转研究。

3. Xu X, et al. Efficient homology-directed gene editing by CRISPR/Cas9 in human stem and primary cells using tube electroporation. Scientific Reports, 2018.查看干细胞与原代T细胞递送研究。

4. CRISPR-mediated Gene Targeting of Human Induced Pluripotent Stem Cells.查看iPSC电转及转染问题排查资料。

5. 威尼德生物：Gene Pulser 830方波电穿孔仪官方技术资料。

6. 威尼德生物：Gene Pulser X2双波电穿孔仪官方技术资料。

7. 图1：NIAID，T Lymphocyte（17382239521），Wikimedia Commons。查看原图；CC BY 2.0授权。图片未修改。

8. 图2：Richard Wheeler（Zephyris），Electroporation Diagram，Wikimedia Commons。查看原图；CC BY-SA 3.0授权。图片未修改。

9. 图3、图4：威尼德生物官方网站Gene Pulser 830与Gene Pulser X2产品实物图。

技术说明：本文介绍难转染细胞在科研实验中的递送困难、方法选择、参数影响因素及结果评价。第三方研究中的递送效率及实验参数不属于威尼德设备实测数据，也不能作为不同电穿孔仪的通用推荐程序。设备支持相应波形不代表全部细胞均已完成实验验证，具体实验应结合细胞类型、递送材料、设备规格及实际结果判断。本文仅用于科研技术交流。