基因敲除电转怎么做？Cas9参数与敲除验证方法

基因敲除（Gene Knockout）是细胞生物学、分子遗传学、免疫学及基因功能研究中常用的实验技术。通过使目标基因发生特定遗传变化，研究人员可以进一步分析该基因对细胞增殖、信号转导、蛋白表达及其他生物学过程的影响。

随着CRISPR-Cas9技术的发展，使用电穿孔将Cas9相关编辑材料导入细胞，已经成为部分细胞基因敲除研究中的重要递送方式。

但对于实验人员而言，基因敲除电转并不是设置一个电压、完成一次放电就能保证成功。

实际研究中，经常遇到以下问题：基因敲除电转需要多少伏？Cas9 RNP与质粒DNA应该如何选择？为什么检测到较高的indel比例，目标蛋白却仍然存在？为什么细胞编辑结果较好，但电转后大量死亡？

这些问题分别涉及编辑材料递送、目标位点切割、细胞DNA修复、蛋白表达及细胞存活等环节。

本文结合公开研究，介绍CRISPR基因敲除原理、电转参数选择、基因敲除效果验证及电穿孔仪选型思路，帮助实验人员区分递送成功、DNA编辑成功与真正的基因功能缺失。

一、基因敲除电转是什么？

基因敲除电转，是指利用电穿孔方法，将CRISPR-Cas9等基因编辑相关材料导入目标细胞，随后通过相应的细胞内编辑过程，获得目标基因功能受到破坏的细胞。

电穿孔是一种物理递送方法。设备通过施加短时电脉冲，改变细胞膜的通透性，为外源分子进入细胞创造条件。

在CRISPR-Cas9基因敲除实验中，常见的递送材料包括：

• 编码Cas9及向导RNA的质粒DNA；

• Cas9 mRNA及相应的向导RNA；

• 预先形成的Cas9蛋白与向导RNA复合物，即Cas9 RNP。

这些材料虽然都可以用于构建CRISPR编辑体系，但其分子性质、细胞内作用过程及递送要求并不完全相同。

需要明确：电穿孔仪负责实现物理递送，而真正的基因敲除需要依赖后续的靶向编辑和DNA修复过程。

二、CRISPR-Cas9基因敲除的基本原理

CRISPR-Cas9基因敲除通常利用向导RNA（gRNA）引导Cas9蛋白识别目标DNA序列。

对于常用的SpCas9，目标识别还需要满足相应的PAM序列条件。

Cas9在目标位置产生DNA双链断裂（Double-Strand Break，DSB）后，细胞会启动自身的DNA修复过程。

其中，非同源末端连接（Non-Homologous End Joining，NHEJ）及相关修复过程，可能在断裂位置产生插入或缺失突变，即indel。

如果这些变化破坏了目标基因的正常编码或功能区域，就可能形成具有功能缺失特征的基因敲除细胞。

1. indel突变不一定造成基因敲除

如果DNA修复过程中产生的插入或缺失改变了阅读框，可能使下游编码序列发生变化，并形成提前终止密码子。

但如果插入或缺失的碱基数量没有改变阅读框，或者突变位于不影响关键功能的区域，细胞仍可能表达具有部分或完整功能的蛋白。

此外，部分提前终止突变仍可能产生截短蛋白；某些细胞还可能通过可变剪接或替代翻译起始等方式保留部分蛋白功能。

因此，检测到indel只能证明存在相应的DNA编辑结果，不能自动证明目标基因已经失去功能。

2. 基因敲除与基因敲入的区别

如果实验目标是破坏基因功能，重点应放在目标位点编辑及功能缺失验证，而不是单纯追求较高的核酸递送阳性率。

三、基因敲除电转选择Cas9 RNP还是质粒？

在选择电转方案时，首先需要明确实际导入的编辑材料。

1. Cas9 RNP电转

Cas9 RNP是Cas9蛋白与向导RNA形成的复合物。

使用RNP递送时，细胞不需要先表达外源Cas9编码DNA，即可在适当条件下获得相应的核酸酶活性。

Cas9 RNP的作用窗口通常较为短暂，因此常用于部分希望限制Cas9持续表达时间的基因编辑研究。

但RNP作用时间短，并不意味着最终的基因组变化也是短暂的。已经形成的稳定基因组编辑结果可以在后续细胞中继续保留。

2. Cas9质粒电转

质粒递送需要将编码Cas9及相关编辑组分的DNA导入细胞，并依赖细胞内相应表达过程产生编辑所需蛋白和RNA。

质粒构建较为灵活，但实际表达时间、表达水平和细胞耐受性可能与RNP体系不同。

3. 两种方式如何选择？

对于原代细胞等实验样品，Cas9 RNP具有公开的电穿孔研究依据，但不代表全部细胞都必须选择RNP。

无论选择哪种编辑材料，都需要依据细胞类型、递送条件和最终编辑结果进行验证。

四、公开研究中的基因敲除电转结果如何？

2018年，Seki和Rutz在《Journal of Experimental Medicine》发表了《Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells》。

该研究分析了Cas9 RNP在人和小鼠原代T细胞中的电转条件，并分别评价递送情况、细胞活率和目标蛋白表达变化。

1. 未激活人原代T细胞的研究结果

研究人员从人PBMC中分离CD4阳性T细胞，使用Lonza 4D-Nucleofector系统开展Cas9 RNP电转。

在针对CXCR4等目标基因进行参数比较后，研究报告了以下实验结果：

这里的约75%来自该研究对目标蛋白缺失情况的评价，不能直接作为全部基因靶点的通用DNA编辑率。

约60%则属于该研究对应条件下的细胞活率，二者是不同指标。

特别注意：EH100和P2均属于该研究使用的Lonza设备及缓冲体系，不能直接作为威尼德Gene Pulser 830或Gene Pulser X2的推荐设置。

2. 不同靶点的敲除结果并不相同

研究人员进一步检测了CXCR4、CCR7、CD127和IFN-γ等不同目标。

在所测试的相关条件下，不同向导RNA和目标基因的敲除结果存在明显差异。

论文报道，相应靶点的目标蛋白缺失比例可以处于约40%—80%的范围，具体取决于所使用的向导RNA和实验条件。

因此，即使使用同一台设备、同一种细胞，改变目标基因或gRNA以后，也不能保证获得相同的敲除效率。

3. 这项研究对实际实验有什么价值？

该研究最重要的意义是说明：

• 基因敲除需要同时考虑递送、细胞活率和目标蛋白结果；

• 不同gRNA可能导致明显不同的敲除表现；

• 不同细胞类型和激活状态可能需要独立优化；

• 设备专用程序不能脱离相应缓冲液及实验体系理解。

上述研究结果不能证明其他品牌设备能够获得相同效率，也不能直接作为不同细胞类型的推荐参数。

五、基因敲除电转参数应该怎样选择？

基因敲除电转没有适用于所有细胞和设备的统一电压。

对于常规电转杯系统，电场强度与施加电压及电极间距有关：

电场强度E＝电压V÷电极间距d。

因此，同一电压作用于不同间距的电转杯，名义电场强度可能不同。

但实际电转效果不仅取决于电场强度，还可能受到脉冲波形、时间、次数、缓冲液及细胞状态等因素影响。

如果设备具有实际波形和脉冲参数记录功能，可以在实验中保存相关信息，辅助区分设备输出变化与细胞、编辑材料造成的差异。

但是，设备正常放电或实际波形正常，不代表目标基因已经成功敲除。

六、基因敲除实验应该如何建立优化流程？

第一步：明确实验目标和细胞类型

确认实验使用的是HEK293、Jurkat、THP-1、原代T细胞还是其他细胞。

不同细胞具有不同的培养特点和电转耐受性，不能直接采用相同的电转条件。

第二步：核对目标基因及gRNA设计

应结合目标基因的转录本、外显子结构及研究目的，分析需要破坏的功能区域。

如果目标基因存在多种转录本，某一gRNA靶向的外显子可能并不包含在全部转录本中。

此外，还应注意靶序列特异性及可能存在的非预期编辑风险。

第三步：确认编辑材料与递送体系

明确采用Cas9 RNP、Cas9 mRNA还是质粒DNA，并检查相应材料质量。

如果参考其他设备的实验方案，应核对完整程序、反应容器和缓冲体系。

第四步：建立适当对照

根据研究目标设置未处理细胞、无载荷电转、非靶向gRNA及经过验证的编辑阳性对照。

通过对照，可以辅助区分电脉冲损伤、非特异处理影响和目标基因编辑带来的变化。

第五步：评价编辑结果和细胞活率

应分别记录目标位点indel、目标蛋白变化、细胞活率和活细胞回收量。

对于需要后续培养或功能研究的样品，不能只以最高indel比例判断参数优劣。

第六步：根据研究目的开展重复验证

如果实验目标是建立稳定基因敲除细胞模型，还需要根据细胞类型及研究要求，进一步开展细胞筛选、基因型确认和功能验证。

七、基因敲除成功应该如何验证？

基因敲除验证是整个实验中最容易被简化的环节之一。

不少实验报告只提供一个indel百分比，就直接将其称为基因敲除效率。

但严格来说，DNA发生变化与目标基因功能真正缺失，需要分别评价。

1. PCR和DNA测序

可以通过适当的靶位点PCR扩增，结合Sanger测序或扩增子深度测序，分析编辑区域的DNA序列变化。

对于混合细胞群体，检测结果可能包含未编辑、不同插入突变和不同缺失突变的细胞。

因此，群体水平indel比例不等于具有完整功能缺失的细胞比例。

2. 分析突变是否造成阅读框变化

如果目标位点位于蛋白编码区，研究人员还应根据实际序列分析突变是否造成移码、提前终止或其他可能影响蛋白功能的变化。

对于多拷贝基因组区域或非典型染色体数目的细胞系，还需要结合实际基因拷贝情况判断。

3. 检测目标蛋白表达

可以根据目标蛋白性质，使用Western blot、流式细胞术或其他合适的蛋白检测方法。

例如，如果目标是细胞表面蛋白，可以在适当条件下使用流式细胞术分析目标蛋白表达缺失情况。

但蛋白检测也需要注意抗体特异性、识别表位及可能存在的截短蛋白。

4. 验证基因功能是否缺失

对于基因功能研究，如果目标蛋白表达下降，还应根据实验目的进一步评价相关生物学功能。

例如，研究某一信号通路相关蛋白，可以比较敲除前后相应信号响应是否发生预期变化。

如果条件允许，使用独立gRNA或经过合理设计的功能恢复实验，可以为目标基因与观察到的表型之间的因果关系提供进一步证据。

5. 判断是否需要单细胞克隆

对于部分稳定细胞系构建项目，可以通过单细胞来源的克隆进行基因型及功能验证。

但不是所有原代细胞研究都适合或必须进行克隆筛选。是否需要获得克隆细胞，应根据细胞特性和实验目的决定。

核心结论：真正可靠的基因敲除结果，应结合目标DNA序列、蛋白表达及实际功能进行判断。

八、基因敲除效率应该怎样计算？

在基因敲除实验中，不同研究可能使用不同的效率定义，比较数据前必须先确认指标。

1. 靶位点indel比例

扩增子测序等方法可以估算目标位点中含有插入或缺失变化的测序读段比例。

该比例反映的是特定检测条件下DNA序列变化的情况，并不直接等于完整基因敲除细胞比例。

2. 目标蛋白阴性细胞比例

如果目标蛋白具有可靠的流式细胞检测方法，可以在适当的活细胞群体中计算目标蛋白阴性细胞的比例。

但是，如果基因本身在对照组中存在表达差异，就需要合理设置阴性阈值和对照。

3. 功能性敲除比例

如果实验存在明确的功能性检测方法，可以根据实际研究目标评价目标基因功能的缺失情况。

这种评价往往更接近基因功能研究的最终目标，但具体方法可能因基因和细胞类型不同而变化。

4. 敲除活细胞回收数量

对于原代T细胞等珍贵样品，如果某组条件获得较高的目标蛋白缺失比例，却造成大量细胞死亡，未必适合后续功能实验。

因此，还应关注最终获得的可用活细胞数量。

当目标蛋白阴性比例以活细胞为分母时，可以按照以下方式估算：

目标蛋白阴性活细胞数量＝回收活细胞数量×活细胞群体内目标蛋白阴性比例。

该指标仍需要结合目标蛋白检测方法和基因型验证来解释，不能将所有蛋白阴性细胞都未经验证地认定为完全基因敲除细胞。

九、基因敲除电转效率低或细胞死亡多，如何排查？

如果出现细胞大量死亡，应首先检查电转前细胞状态及无载荷电转对照。

如果电转后细胞存活良好，但目标位点编辑不理想，则应优先确认gRNA、Cas9材料及实际编辑体系，而不是直接改变电压。

如果indel比例较高而目标蛋白未明显下降，应重点分析编辑序列和目标蛋白稳定性。

只有区分递送、编辑和蛋白功能三个环节，才能减少无效的参数调整。

十、基因敲除电转如何选择电穿孔仪？

对于需要开展CRISPR相关材料递送的实验室，设备选型应重点考虑目标细胞类型、输出波形、脉冲调节能力、实际输出监测及耗材适配性。

需要强调，电穿孔仪能够提供外源分子的物理递送条件，并不能独立决定CRISPR基因敲除效率。

1. Gene Pulser 830方波电穿孔仪

威尼德Gene Pulser 830采用方波输出方式，面向哺乳动物细胞、悬浮细胞及原代细胞等研究应用。

根据威尼德官方产品技术资料，该设备支持脉冲时间、间隔及次数设置，具有实际波形显示、预脉冲电阻测量、实验程序存储及历史记录查询功能。

如果实验室主要开展细胞转染、基因编辑相关材料递送及方波参数探索，可以结合目标细胞、脉冲要求和实验资料评估该设备。

产品详情：Gene Pulser 830方波电穿孔仪。

2. Gene Pulser X2双波电穿孔仪

威尼德Gene Pulser X2集成方波和指数衰减波两种输出方式，可供同时开展哺乳动物细胞转染和微生物电转化的实验室进行选型。

根据官方资料，该设备具有实际波形监测、预脉冲电阻检测、电弧保护及相关程序设置功能。

如果实验室既需要开展细胞递送研究，也需要进行细菌或酵母电转化，可以根据不同项目的波形要求评估双波系统。

产品详情：Gene Pulser X2双波电穿孔仪。

产品适用性说明：威尼德官方资料可以证明上述设备具备相应的波形及参数设置能力，但本文没有引用Gene Pulser 830或Gene Pulser X2针对特定CRISPR基因敲除实验的独立实测数据。

因此，本文不将第三方论文中的基因敲除效率归属于威尼德设备，也不把Lonza EH100等其他品牌的专用程序作为威尼德推荐参数。

设备是否适合某一具体基因编辑项目，应结合实际细胞、递送材料、完整脉冲要求及试验验证结果判断。

十一、基因敲除电转常见问题

1. 基因敲除电转一般需要多少伏？

没有适用于全部细胞和电转设备的固定电压。需要结合细胞类型、波形、电极间距、脉冲时间、缓冲体系及可靠研究资料确定实验条件。

2. 基因敲除一定需要使用Cas9 RNP吗？

不一定。除了Cas9 RNP，还可以根据实验设计采用质粒DNA、Cas9 mRNA等形式递送编辑组分。具体选择应结合实验目标和已有验证依据。

3. 基因敲除和基因敲入可以使用相同电转参数吗？

不能默认相同。敲入实验通常还涉及供体DNA等额外材料，可能改变递送体系和细胞耐受性，需要分别验证。

4. indel比例达到80%，是不是基因敲除效率就是80%？

不是。indel比例反映目标DNA序列变化，不一定对应80%的细胞完全失去目标基因功能。仍需结合等位基因、蛋白表达和功能检测判断。

5. Cas9 RNP电转后多久检测基因敲除？

检测时间取决于目标细胞、靶基因及检测方法。DNA编辑结果、目标蛋白减少和后续功能变化可能具有不同时间窗口，不能直接使用统一检测时间。

6. 基因敲除后还需要做Western blot吗？

如果研究目标涉及蛋白功能，通常需要考虑相应的蛋白检测。对于细胞表面蛋白，也可依据目标性质选择可靠的流式细胞检测等方法。具体应以目标基因和实验目的为准。

7. 基因敲除必须进行单细胞克隆筛选吗？

不一定。如果需要建立基因型明确、能够长期培养的细胞系，单细胞来源克隆可能具有重要价值。对于部分原代细胞及短期功能研究，经过充分验证的混合编辑群体也可能符合研究要求。

8. 电穿孔仪能够保证基因敲除成功吗？

不能。电穿孔仪负责执行相应电脉冲并辅助递送编辑材料，真正的敲除结果还受到gRNA、Cas9活性、目标位点、DNA修复及细胞状态等多方面影响。

十二、基因敲除电转设备与实验需求咨询

对于正在开展CRISPR基因敲除、Cas9 RNP递送和其他细胞基因功能研究的实验室，设备选型需要结合实际细胞类型和递送需求。

如果目前遇到编辑比例偏低、细胞死亡增加、目标蛋白不下降或实验结果重复性差等问题，建议先整理以下信息：

• 目标细胞名称、来源及培养状态；

• 目标基因与主要研究目的；

• Cas9及gRNA的递送形式；

• 当前设备型号、波形和电转耗材；

• 现有完整脉冲参数及实际放电记录；

• 细胞活率、活细胞回收数量及检测时间；

• 已有的indel、蛋白表达和功能检测结果；

• 是否需要建立长期培养的稳定基因敲除细胞系。

威尼德生物科技（北京）有限公司提供方波及双波电穿孔仪，可结合科研实验需求沟通设备波形、脉冲参数、实际输出监测及电转耗材适配问题。

产品中心：查看威尼德电穿孔仪产品与技术参数

相关技术文章：基因导入仪怎么选？DNA、mRNA与RNP递送设备指南

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咨询电话：15532415159

十三、参考资料与图片来源

1. Seki A, Rutz S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. Journal of Experimental Medicine, 2018.查看原代T细胞基因敲除电转研究。

2. Addgene. CRISPR Guide: Plan Your Experiment.查看CRISPR实验设计、细胞群体及编辑验证资料。

3. Generating Single Cell-Derived Knockout Clones in Mammalian Cells with CRISPR/Cas9.查看基因敲除细胞克隆与蛋白验证技术资料。

4. Simplified Gene Knockout by CRISPR-Cas9-Induced Homologous Recombination.查看基因敲除、indel及蛋白功能验证相关研究。

5. Ding Y, Li H, Chen LL, Xie K. Recent Advances in Genome Editing Using CRISPR/Cas9. Frontiers in Plant Science, 2016.查看CRISPR与DNA修复机制资料。

6. 威尼德生物：Gene Pulser 830方波电穿孔仪官方产品资料。

7. 威尼德生物：Gene Pulser X2双波电穿孔仪官方产品资料。

8. 图1：Ding Y等，Recent Advances in Genome Editing Using CRISPR/Cas9，Frontiers in Plant Science，2016，Figure 1。查看原图与研究来源；CC BY 4.0授权。图片未修改。

9. 图2：Richard Wheeler（Zephyris），Electroporation Diagram，Wikimedia Commons。查看原图；CC BY-SA 3.0授权。图片未修改。

10. 图3、图4：威尼德生物官方网站Gene Pulser 830与Gene Pulser X2产品实物图。

技术说明：本文介绍基因敲除电转的基本原理、Cas9材料递送、参数选择及实验验证方法。文中第三方研究结果不属于威尼德设备独立实测数据，不能作为不同电穿孔仪的通用推荐设置。设备正常完成电脉冲不代表目标基因已经成功敲除，具体实验应结合细胞、编辑材料、设备技术规格及分子和功能验证结果进行判断。本文仅用于科研技术交流，不构成临床基因编辑应用声明。