巨噬细胞Cas9 RNP电转，分化状态影响哪些结果？

在CRISPR/Cas9基因编辑研究中，巨噬细胞是一类具有重要研究价值、但实验条件需要谨慎评估的细胞。

部分实验室已经在THP-1细胞或其他哺乳动物细胞中建立了Cas9 RNP电转方案，但当实验转向原代单核细胞、单核细胞来源巨噬细胞（MDM）或已经完成分化的巨噬细胞时，却发现原有参数难以直接沿用。

例如，研究人员希望通过Cas9 RNP敲除某个与巨噬细胞炎症反应有关的基因，却发现不同分化阶段的细胞，在电转后的存活、目标位点编辑以及后续细胞功能方面存在差异。

面对这种情况，应该先编辑单核细胞再诱导分化，还是等巨噬细胞成熟以后再进行电转？如果分化以后编辑效果下降，是不是需要提高电转电压？

巨噬细胞Cas9 RNP电转需要先区分细胞来源和分化阶段。电转时的细胞状态不仅关系到RNP递送和细胞存活，还可能影响后续分化、基因编辑结果和功能检测。

因此，建立实验方案前，应先明确研究目标，再选择合适的细胞模型及编辑阶段，而不是直接复制其他巨噬细胞研究中的电脉冲参数。

一、巨噬细胞Cas9 RNP电转，为什么要先区分细胞模型？

实验室中常见的巨噬细胞研究模型，主要包括THP-1来源的巨噬细胞样细胞、原代单核细胞来源巨噬细胞，以及其他组织或诱导分化来源的巨噬细胞。

这些模型虽然都可以用于研究巨噬细胞相关功能，但并不是完全相同的细胞体系。

其中，THP-1细胞虽然能够被诱导形成巨噬细胞样表型，但不能直接等同于人原代巨噬细胞。

不同模型之间可能存在基因表达、炎症信号、代谢状态及增殖能力等差异。

因此，实验室在寻找巨噬细胞电转参数之前，应该首先明确实际使用的是哪一种细胞。

图1：巨噬细胞形态示意图，并非特定电转实验的显微图像。图片来源：NIAID NIH BioArt，Ryan Kissinger，美国公共领域素材。查看图片来源。

二、Cas9 RNP应该在巨噬细胞分化前还是分化后递送？

两种研究路线均有相应应用场景，但不能简单认定其中一种一定更有效。

路线一：先编辑单核细胞，再诱导分化为巨噬细胞

这种路线是在单核细胞阶段完成Cas9 RNP递送与基因编辑，随后通过相应培养条件使细胞分化为巨噬细胞。

2021年发表于《Cell Reports》的研究，利用Cas9 RNP对人原代CD14+单核细胞进行基因编辑，并使编辑后的细胞继续分化为巨噬细胞或树突状细胞。

研究表明，在该实验体系中，可以通过这一方式获得可用于后续研究的编辑髓系细胞。

这种路线值得关注的一个原因是：研究人员可以在分化之前完成RNP递送，并将后续细胞分化与功能检测纳入整个实验流程。

但需要注意，如果目标基因本身参与巨噬细胞分化，那么提前敲除该基因就可能改变最终获得的细胞群体。

因此，先编辑再分化并不意味着可以忽略分化率和细胞表型。

路线二：先完成分化，再对巨噬细胞进行RNP电转

如果研究目标是观察某个基因在相对成熟巨噬细胞中的作用，研究人员可能希望在细胞已经形成特定表型以后，再开展编辑。

但已经分化的巨噬细胞往往具有较强的贴壁性，部分模型的增殖能力有限。

如果需要将贴壁细胞重新制备为电转所需的单细胞悬液，细胞收集和解离过程本身就可能带来损耗及状态变化。

此外，对于已经分化的巨噬细胞，RNP编辑以后可能没有足够的细胞扩增空间，无法依靠后续培养轻易弥补细胞损失。

因此，如果计划对成熟巨噬细胞直接电转，应当首先核对所使用的设备、耗材和文献是否支持这一细胞阶段，而不能将单核细胞或未分化THP-1的成功程序直接套用。

三、分化状态会影响巨噬细胞RNP电转的哪些结果？

1. 细胞存活与实际回收量

细胞在不同分化阶段的形态、培养依赖性和应激反应可能存在差异。

对于贴壁巨噬细胞，电转前的收集、洗涤和重悬，也可能造成额外细胞损失。

因此，应同时记录电转前可用细胞数量、电转后细胞活率以及最终实际回收的活细胞数量。

不能只根据电转后的活率百分比判断某个方案是否适合后续研究。

2. RNP递送与基因组编辑结果

不同细胞阶段的电学特征和生物学状态可能不同，因此原有电脉冲条件未必具有相同的递送表现。

但即使检测到RNP相关荧光信号，也不能直接认定目标DNA已经成功编辑。

巨噬细胞具有较强的物质摄取能力，部分递送示踪信号可能受到细胞表面结合或摄取途径等因素影响。

因此，最终仍然需要通过适当的靶位点测序或其他经过验证的检测方法确认编辑结果。

3. 分化能力与细胞表型

如果采用先编辑单核细胞、再诱导巨噬细胞分化的路线，就需要确认编辑后的细胞是否能够形成符合实验要求的巨噬细胞表型。

尤其是当目标基因参与细胞分化、免疫信号或细胞生存调节时，最终的分化结果可能发生变化。

4. 炎症反应与细胞功能

巨噬细胞常用于研究炎症信号、吞噬作用和免疫调节。

电转过程、细胞处理以及目标基因编辑本身，都可能影响后续功能检测。

因此，不能只根据Cas9 RNP编辑比例判断实验成功，还需要结合最终研究目的评价细胞功能。

四、已有研究对巨噬细胞RNP电转提供了哪些证据？

目前公开研究已经在不同髓系细胞模型中探索了Cas9 RNP递送与基因编辑。

人原代单核细胞：先编辑，再分化

Hiatt等人在2021年的《Cell Reports》研究中，利用Cas9 RNP对人原代单核细胞进行编辑，并进一步获得单核细胞来源巨噬细胞和树突状细胞。

这项研究提供了一种将基因编辑与后续髓系细胞分化相结合的技术思路。

THP-1细胞：编辑和单克隆筛选可与后续分化结合

2025年发表于《Journal of Visualized Experiments》的研究，介绍了利用电穿孔递送Cas9 RNP，在THP-1细胞中完成基因敲除及单细胞克隆分离的实验方法。

但THP-1是一种可扩增的细胞系，其单克隆建系能力不能直接代表原代巨噬细胞的实际情况。

小鼠骨髓来源细胞：编辑与分化可以连续评价

2026年发表于《Frontiers in Immunology》的研究，针对小鼠骨髓来源细胞建立了RNP电转条件，并在后续分化为骨髓来源巨噬细胞的过程中评价细胞状态及基因编辑结果。

该研究在特定电转平台上获得了可检测的RNP递送、细胞存活和目标蛋白变化。

但应特别区分：其相关实验是先处理骨髓来源细胞，再进行巨噬细胞分化，并不能直接证明相同条件适用于已经成熟的贴壁巨噬细胞。

图2：研究人员对小鼠骨髓来源细胞进行电转，并评价细胞活率、递送信号及后续巨噬细胞分化后的蛋白表达。此图为原研究设备的实验数据，并非威尼德产品实测结果。图源：Oh等，Frontiers in Immunology，2026，CC BY 4.0。查看原始文献。

这些研究表明，巨噬细胞相关CRISPR RNP编辑具有不同可行路线，但其细胞来源、编辑阶段及设备平台不同，不能直接合并为一套通用电转参数。

五、THP-1细胞分化前后，电转方案能直接沿用吗？

不能简单沿用。

THP-1是一种人单核细胞样细胞系，在适当条件下可以通过PMA等处理形成巨噬细胞样表型。

未分化THP-1与PMA处理后的THP-1来源巨噬细胞样细胞，在细胞形态、贴壁状态、增殖能力和免疫表型等方面可能存在明显差异。

因此，未分化THP-1阶段得到的电转条件，不能直接证明适用于分化后的细胞。

此外，PMA处理条件和后续恢复时间本身也可能影响巨噬细胞样表型。

如果实验的最终目的是评价某个基因在巨噬细胞中的功能，可以考虑采用先在THP-1阶段完成编辑和必要验证，再诱导其分化的研究思路。

但这只是一种可供评估的路线。如果目标基因会影响分化过程，就必须进一步区分基因编辑对分化的影响和对成熟巨噬细胞功能的影响。

六、M1和M2状态，会影响Cas9 RNP实验结果吗？

巨噬细胞研究中，经常使用M1、M2等术语描述不同刺激条件下的功能状态。

但需要明确，M1与M2是常见的研究分类方式，并不能完整概括巨噬细胞在不同组织和环境中的全部状态。

2014年发表于《Immunity》的巨噬细胞活化研究指南强调，应明确报告细胞来源、刺激条件及相关标志物，而不应仅通过M1或M2名称描述实验细胞。

对于Cas9 RNP电转实验，这意味着研究人员需要区分两个问题：

• 细胞是否已经从单核细胞分化为巨噬细胞；

• 分化后的巨噬细胞接受了什么刺激，处于何种功能状态。

如果电转之前或之后改变了巨噬细胞刺激条件，相关炎症和功能检测结果可能受到影响。

因此，应记录具体的培养条件和刺激方式，并结合适合的表面标志物、基因表达及功能检测评价状态。

不能只观察单个CD标志物，就认定巨噬细胞已经完成特定功能分化。

七、巨噬细胞RNP编辑后，应该检测哪些指标？

巨噬细胞基因编辑实验的评价标准，应根据研究目的是基因敲除、炎症通路研究还是吞噬功能分析确定。

对于功能性基因敲除，基因组中出现Indel并不一定意味着目标蛋白已经完全失活。

如果目标蛋白具有较长的稳定时间，还需要合理安排后续检测，以免把蛋白残留误判为RNP电转失败。

对于巨噬细胞吞噬功能研究，还应确认所采用的检测方法能够区分细胞摄取、细胞存活及相关背景信号。

八、怎样设置对照，区分分化差异与电转影响？

如果实验室计划比较巨噬细胞分化前后的基因编辑效果，建议优先明确每组实验需要回答的问题。

这些分组需要结合样本资源和实验目的调整，不代表所有项目都必须设置相同数量的反应。

如果比较分化前编辑与分化后编辑，还需要明确：两组之间除了编辑时间不同，可能同时存在细胞收集方式、培养环境和恢复条件的差异。

因此，不能简单把所有结果差异都归因于电转电压。

九、巨噬细胞RNP电转失败，建议如何排查？

例如，如果原代单核细胞完成RNP电转后，细胞能够存活并检测到基因组编辑，但后续巨噬细胞分化率明显下降，那么下一步应重点检查分化条件及目标基因作用。

如果未分化THP-1的电转条件稳定，而分化后THP-1来源巨噬细胞样细胞表现不佳，就需要重新评估细胞阶段与设备耗材的适配性，而不能默认两种状态具有相同的电学和生物学响应。

十、巨噬细胞Cas9 RNP电转，设备选型应关注什么？

对于巨噬细胞基因编辑实验，电转仪主要提供可控电脉冲，用于将RNP递送进入适合的目标细胞。

设备本身不能决定巨噬细胞是否完成分化，也不能保证目标基因敲除后一定出现预期的炎症或吞噬功能变化。

因此，选型应优先核对以下要求：

• 目标细胞是未分化THP-1、原代单核细胞还是已分化巨噬细胞；

• 是否能够以符合设备要求的状态制备细胞悬液；

• 配套电极杯是否支持计划使用的反应体积；

• 设备是否具备所需脉冲波形及参数调节能力；

• 是否能够查看实际脉冲输出和异常状态；

• 是否便于保存已验证的实验程序和历史记录。

Gene Pulser 830方波电穿孔仪

对于准备建立哺乳动物细胞方波RNP电转方案的实验室，可以评估威尼德Gene Pulser 830方波电穿孔仪。

根据威尼德公开产品资料，Gene Pulser 830具有以下功能：

• 方波脉冲输出，支持脉冲强度和时间调节；

• 支持多个不同脉冲时间和间隔的组合设置；

• 可显示实际脉冲电压、时间及波形；

• 支持预脉冲样品电阻测量；

• 具备电弧保护和相关安全放电功能；

• 可保存600条实验方案，并查询100条历史记录。

这些功能可以用于符合设备工作范围的细胞电转条件开发，并帮助研究人员保存、比较和核对不同实验程序。

图3：威尼德Gene Pulser 830方波电穿孔仪。实际能否用于特定巨噬细胞模型，应结合设备耗材要求和目标细胞试机结果确认。

需要明确：当前公开的Gene Pulser 830产品资料介绍了真核细胞电转功能，但不能据此认定该设备已经在所有巨噬细胞模型、分化阶段或Cas9 RNP组合中完成了应用验证。

对于细胞来源珍贵、样本量有限的原代巨噬细胞研究，建议在使用正式实验样本前，优先核对设备与耗材要求，并与厂家沟通相关适配和试机条件。

十一、采购巨噬细胞电转设备前，应该向厂家提供哪些信息？

如果实验室计划从普通细胞系研究转向巨噬细胞Cas9 RNP电转，建议提前整理：

• 实际使用的是THP-1、原代单核细胞还是其他巨噬细胞模型；

• 细胞来源于人还是小鼠；

• 计划在分化前还是分化后进行电转；

• 当前是否已经有成功的Cas9 RNP编辑程序；

• 目标基因是否可能影响细胞分化或存活；

• 每次计划处理的活细胞数量和反应体积；

• 是否需要电转后继续分化和功能检测；

• 目前主要遇到的是编辑率低、细胞死亡还是功能异常。

相比直接询问“巨噬细胞电转电压是多少”，提供这些具体信息更有助于判断设备是否适合当前项目。

十二、巨噬细胞Cas9 RNP电转常见问题

1. THP-1和人原代巨噬细胞能使用相同的电转参数吗？

不能直接假设可以。两者来源、培养状态和生物学特征存在差异，应分别核对设备、耗材和实验验证条件。

2. 巨噬细胞一定要在分化前进行Cas9 RNP电转吗？

不一定。已有研究采用先编辑单核细胞或前体细胞、再诱导分化的方式，但是否适合当前项目，应结合目标基因、实验目的和细胞来源判断。

3. 分化后的巨噬细胞电转效果差，可以直接提高电压吗？

不建议直接提高。应先检查细胞回收和重悬、实际电脉冲、RNP质量及电转后恢复。提高电压可能增加细胞损伤，却不一定改善基因编辑结果。

4. 巨噬细胞检测到RNP荧光，就代表基因编辑成功吗？

不能。递送相关荧光信号与目标DNA编辑属于不同指标，需要通过相应的基因组检测方法确认。

5. M1与M2巨噬细胞需要不同电转程序吗？

不能仅根据M1或M2名称决定。应明确细胞来源、刺激条件、培养阶段和实际实验结果，再判断是否需要重新验证电脉冲条件。

6. 巨噬细胞CRISPR基因敲除成功，为什么吞噬功能没有变化？

可能与目标基因本身的作用、细胞状态、功能检测条件或基因编辑类型有关。基因组发生编辑，并不保证一定产生特定的功能变化。

十三、巨噬细胞Cas9 RNP电转，关键是明确编辑阶段与最终实验目标

巨噬细胞Cas9 RNP电转不能只关注电压、脉冲时间和递送效率。

对于未分化THP-1、原代单核细胞和已经分化的巨噬细胞，研究人员需要分别考虑细胞来源、分化能力、电脉冲耐受性和后续功能检测。

如果采用先编辑再分化的路线，重点是确认编辑后细胞能否形成符合要求的巨噬细胞表型。

如果采用分化后再编辑的路线，则需要格外关注细胞收集、短期存活、可用细胞数量及功能保持。

因此，真正适合的方案应该同时满足目标位点编辑、活细胞回收和后续实验需求，而不是单纯追求某个时间点的递送阳性率。

正在开展巨噬细胞Cas9 RNP电转，遇到原代单核细胞编辑率不足、THP-1分化后电转效果变化，或者不确定现有电转仪是否适合目标细胞？

可以向威尼德提供细胞来源、分化状态、现有电转设备、Cas9 RNP体系和具体实验问题，进一步沟通方波电穿孔仪的参数功能、耗材要求与试机适配事项。

技术咨询电话：15532415159

相关设备：Gene Pulser 830方波电穿孔仪

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技术参考文献

• Hiatt J, et al. Efficient generation of isogenic primary human myeloid cells using CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins. Cell Reports, 2021.

• Liao X, Li L. CRISPR-Cas9-Induced Gene Editing in Primary Human Monocytes. Methods in Molecular Biology, 2024.

• Pinaud M, Zamborlini A. Electroporation-Based CRISPR-Cas9-Mediated Gene Knockout in THP-1 Cells and Single-Cell Clone Isolation. JoVE, 2025.

• Oh JH, et al. Versatile electroporation protocols enable reproducible CRISPR-RNP delivery across multiple primary mouse cells of the hematopoietic lineage. Frontiers in Immunology, 2026.

• Murray PJ, et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity, 2014.

技术说明：本文用于巨噬细胞Cas9 RNP电转、分化状态比较及设备选型研究参考。不同细胞模型、分化阶段和电转平台的研究结果不能直接互换。文中所引用的科研数据均为相应研究体系的结果，不代表威尼德电转仪实测数据。具体设备适配性及细胞编辑效果，应以产品资料和实际验证为准。