Cas9和Cas12a RNP电转参数能通用吗？

在CRISPR基因编辑实验中，部分研究人员已经建立了成熟的Cas9 RNP电转方案，但随着项目需求变化，希望进一步使用Cas12a（Cpf1）进行基因敲除、精准编辑或多靶点研究。

例如，实验室原来使用Cas9 RNP对原代T细胞进行电穿孔递送，已经确定了一组能够兼顾目标位点编辑和细胞存活的电脉冲条件。现在准备将核酸酶更换为Cas12a，是否可以继续使用原来的电压、脉冲时间和电转杯？

如果原有Cas9 RNP电转效率较高，是否意味着Cas12a RNP在相同条件下也能够获得接近的编辑结果？

这些问题直接关系到实验室是否需要重新进行参数筛选，以及现有电转设备是否仍然适用。

Cas9和Cas12a都可以通过电穿孔递送，但不能直接认定两者的RNP电转参数完全通用。

对于相同细胞、相同设备和相同耗材，原有Cas9电脉冲程序可以作为Cas12a实验的候选起点之一。但由于两种核酸酶的向导RNA结构、RNP组成、靶点识别和编辑活性存在差异，最终仍然需要重新确认Cas12a的编辑结果及细胞耐受性。

一、Cas9和Cas12a RNP有哪些主要区别？

Cas9和Cas12a都属于CRISPR相关核酸酶，但两者并不是可以直接互换的蛋白。

实验室中常见的Cas9体系包括来源于化脓性链球菌的SpCas9；常见Cas12a体系则包括AsCas12a、LbCas12a及经过工程化改造的不同版本。

不同Cas蛋白具有各自的DNA识别和切割特点。

其中，PAM是Cas蛋白识别目标DNA时需要考虑的邻近序列。表中的N代表任意碱基，V代表A、C或G。

需要特别注意，Cas12a存在不同天然同源蛋白和工程化变体，其PAM兼容范围和编辑活性可能不同。因此，不能认为全部Cas12a产品都具有完全相同的靶点识别要求。

图1：Cas12a与Cas9典型PAM、向导RNA及DNA切割位置比较。图片来源：J.J.Froehlich / Wikimedia Commons，CC BY-SA 4.0，图片未修改。

二、为什么Cas9与Cas12a不能直接使用相同的RNP配方？

Cas9和Cas12a虽然都以RNP形式进行递送，但RNP复合物的组成和组装要求不同。

1. 向导RNA不能直接互换

常见SpCas9可以使用sgRNA，也可以通过crRNA与tracrRNA形成相应的引导体系。

Cas12a通常使用与自身蛋白相匹配的crRNA。

因此，原来的Cas9 sgRNA不能简单替换蛋白后继续作为Cas12a的向导RNA使用。

2. RNP配比需要依据对应体系确认

不同Cas蛋白与向导RNA之间的组装要求、反应体系及推荐投入量，可能存在差异。

如果原来的Cas9实验记录只保存了蛋白质量，例如多少微克，而没有记录实际物质的量，就不能直接认为相同质量的Cas12a能够提供相同数量的RNP分子。

即使按照相同摩尔量进行比较，也不代表不同核酸酶具有相同的基因组编辑活性。

3. Cas12a不同版本之间也可能存在差异

2021年发表于《Nature Communications》的研究，比较了野生型AsCas12a与工程化AsCas12a Ultra在不同细胞中的编辑表现。

研究人员观察到，两种蛋白在相同研究体系中的编辑活性和剂量响应存在差异。

这说明，即使同属于Cas12a体系，也不能直接认为不同版本在相同RNP投入量下具有相同的编辑效果。

因此，从Cas9切换到Cas12a时，除了核对电脉冲程序，还需要独立确认Cas12a蛋白、crRNA及RNP组装条件。

三、Cas9原来的电压和脉冲时间，哪些情况下可以作为参考？

电穿孔利用电脉冲暂时改变细胞膜通透性，从而实现核酸或蛋白质等分子的递送。

电脉冲是否适合目标细胞，受到细胞类型、细胞状态、样品体系、电极结构和设备输出条件等因素影响。

因此，Cas9与Cas12a使用同一种目标细胞，并不必然需要从完全不同的电脉冲条件开始。

例如，如果实验室已经在相同T细胞、同一电转仪、相同电转杯和缓冲液条件下，建立了能够稳定递送Cas9 RNP的方波程序，那么该程序可以作为Cas12a初步适配验证的候选条件。

但必须区分：可以参考原有程序，不等于原有程序已经得到Cas12a实验验证。

哪些条件值得保留作为初始参考？

• 已经确认适用于目标细胞的电转设备及耗材；

• 符合设备要求的电转缓冲体系和样品体积；

• 已经建立成功的基础电脉冲程序；

• 经过验证的细胞收集、培养及恢复流程；

• 原来用于评价活率和活细胞回收量的方法。

上述条件可以帮助减少不必要的重复摸索，但需要重新确认更换递送材料以后，样品状态、细胞存活及目标编辑结果是否仍然符合要求。

四、从Cas9改为Cas12a，哪些条件必须重新验证？

对于计划切换CRISPR核酸酶的实验室，可以把需要验证的变量分为递送材料、电脉冲适配和基因编辑结果三个方面。

特别需要注意，Cas9和Cas12a的目标切割位置可能不同。

如果实验室继续使用原来针对Cas9切割位置设计的检测分析流程，需要确认PCR扩增区域和测序分析窗口是否仍然覆盖Cas12a的实际编辑位置。

如果使用不同目标位点进行Cas9和Cas12a比较，还应明确靶点差异本身可能影响编辑结果，不能将所有变化都归因于核酸酶或电转仪。

五、Cas12a RNP电转的编辑效率，为什么不能直接参考Cas9？

编辑效率不仅取决于RNP是否成功进入细胞，还与目标DNA序列、核酸酶活性、细胞状态及DNA修复过程有关。

例如，某个Cas9 gRNA在T细胞中具有较高编辑活性，并不代表选择相邻位点的Cas12a crRNA以后，也一定能够获得相同结果。

此外，Cas12a不同版本之间也可能出现较大的活性差异。

Zhang等人在2021年发表的AsCas12a Ultra研究中，通过电转将相应RNP递送至原代T细胞、NK细胞、造血干/祖细胞等体系，比较了不同核酸酶版本及RNP浓度下的编辑表现。

研究显示，使用的Cas12a版本、目标位点和RNP浓度，均可能影响实际编辑结果。

图2：AsCas12a野生型与Ultra版本在原代细胞中的RNP剂量和编辑表现对比。图片来源：Zhang等，Nature Communications，2021，CC BY 4.0，图片未修改。图中数据来自原研究使用的平台及条件，不属于威尼德设备实测数据。

这些研究说明，Cas12a RNP的编辑效果需要依据自身实验体系进行评价，不能因为原来Cas9编辑比例较高，就默认Cas12a也具有同样表现。

六、怎样比较Cas9和Cas12a RNP电转的实际效果？

如果实验室已经有成熟的Cas9条件，建议先明确比较的目标是递送效率、基因敲除效果，还是最终可用编辑细胞数量。

1. 尽量统一与核酸酶无关的变量

在可行的情况下，应保持相同细胞来源、培养状态、反应耗材以及经过验证的恢复流程，以减少不必要的差异。

2. 分别验证两种核酸酶的活性

Cas9和Cas12a需要使用各自匹配的向导RNA和检测方法。

如果Cas12a尚未经过独立验证，应先确认其能够在目标细胞中产生可检测编辑，再评价与既有Cas9程序的差异。

3. 同时记录编辑效率与细胞存活

如果某组Cas12a实验的编辑比例较高，但细胞活率明显下降，最终能够用于后续实验的活细胞数量可能并不理想。

因此，可以综合考虑目标位点编辑率、活细胞回收量、必要的蛋白功能变化及后续培养表现。

4. 不应直接比较不同设备的电压数字

不同电转平台的电极结构、缓冲液以及实际脉冲波形可能不同。

即使两台设备显示相同的电压，也不代表细胞实际受到完全相同的电场作用。

因此，文献中的电转程序必须结合具体设备型号与耗材理解，不能仅复制一个电压值。

七、Cas9正常、Cas12a编辑效率低，应该如何排查？

如果原来的Cas9 RNP电转稳定，但更换Cas12a以后目标编辑率明显下降，建议先区分细胞递送问题和核酸酶编辑问题。

如果Cas12a RNP在已经验证的阳性对照靶点也无法产生可接受编辑，应首先检查蛋白、crRNA和递送体系。

如果阳性对照正常，只有当前研究目标编辑率偏低，则更值得优先检查目标位点和crRNA相关因素。

不能因为Cas12a编辑失败，就直接认定原有电转仪不支持Cas12a。

八、Cas9和Cas12a的DNA修复结果，可以直接比较吗？

Cas9和Cas12a在DNA切割位置及典型末端结构上存在差异，但最终细胞修复结果还受到DNA修复途径、目标序列和细胞状态影响。

因此，两者可能产生不同的插入缺失突变分布。

如果实验目标是基因敲除，应根据实际需要评价突变是否造成了功能破坏，不能只比较总体Indel比例。

如果研究目标是HDR精准基因敲入，则还需要分别评估供体设计、切割位置和细胞修复情况。

此外，不能简单认为Cas12a产生交错末端，就一定比Cas9更适合精准敲入。不同研究体系中的HDR结果可能存在明显差异。

对于需要比较两种核酸酶的项目，建议提前统一评价终点，例如：

• 实际基因组编辑比例；

• 预期功能性敲除比例；

• 活细胞回收量；

• 需要时的精准敲入比例；

• 必要的非预期编辑及基因组完整性检查。

只有明确检测目的，Cas9与Cas12a之间的比较才具有实际解释价值。

九、现有Cas9电转仪能否继续用于Cas12a？

如果实验室已经拥有用于Cas9 RNP递送的电穿孔仪，准备改用Cas12a时，不一定需要立即采购另一台设备。

两种核酸酶都可以通过适合的电穿孔方式递送，因此首先应检查现有设备能否满足目标细胞的脉冲要求，以及新的Cas12a RNP体系是否与耗材和反应条件相容。

建议重点核查：

• 设备支持的波形是否符合当前细胞的递送方案；

• 电压、脉冲时间及次数的设置范围是否满足研究需求；

• 电极杯和有效反应体积是否匹配；

• 是否具备实际脉冲输出记录；

• 是否能够检查样品异常状态；

• 是否方便保存原有Cas9及新Cas12a实验程序。

如果现有设备具备需要的功能，并且能够通过试机验证Cas12a的实际适配性，就没有必要仅因为更换核酸酶名称而直接更换设备。

十、Gene Pulser 830能否用于Cas9与Cas12a RNP电转方案评估？

对于主要开展哺乳动物细胞和原代免疫细胞方波电转研究的实验室，可以了解威尼德Gene Pulser 830方波电穿孔仪。

根据威尼德公开产品资料，Gene Pulser 830支持：

• 方波脉冲输出，独立调节脉冲强度和时间；

• 多个不同脉冲时间及间隔的组合设置；

• 实际电压、脉冲时间、次数及波形显示；

• 预脉冲样品电阻测量；

• 电弧保护和异常情况下的安全放电；

• 600条实验方案保存及100条历史记录查询。

对于正在从Cas9 RNP切换到Cas12a RNP的实验室，设备的实际输出显示和程序保存功能，可以帮助记录两种递送体系所使用的脉冲条件，并在实验结果发生变化时检查设备端信息。

图3：威尼德Gene Pulser 830方波电穿孔仪，可用于符合设备要求的细胞电转程序设置、实际脉冲记录及适配性评估。

需要明确的是，Gene Pulser 830公开产品资料中的细胞转染应用及设备功能，不能直接视为该设备已经取得特定Cas12a RNP编辑效率的验证结果。

对于Cas12a项目，应提供具体细胞类型、Cas12a蛋白版本、crRNA体系及计划使用的反应条件，再确认设备和耗材是否适合。

因此，设备选型的重点不是简单判断“支持Cas9还是Cas12a”，而是判断设备的电脉冲能力、耗材范围及实验验证条件，是否满足实际细胞RNP递送需求。

十一、Cas9切换Cas12a，采购或试机前应该提供哪些信息？

如果实验室正在评估现有设备能否用于Cas12a，或者计划采购新的CRISPR RNP电转仪，可以提前整理以下资料：

• 目标细胞类型，例如T细胞、NK细胞、HEK293或其他细胞；

• 现有Cas9 RNP电转是否已经成功；

• 当前使用的电转仪型号及脉冲波形；

• 准备采用的Cas12a蛋白类型及版本；

• crRNA是否已经在目标细胞中完成验证；

• 计划使用的细胞数量、耗材及反应体积；

• 主要目标是基因敲除、精准敲入还是多靶点编辑；

• 当前主要问题是编辑效率不足还是细胞活率下降。

这些信息能够帮助判断原有条件中哪些可以继续参考，哪些需要进行独立验证，也有利于减少重复尝试无关参数造成的时间和样本消耗。

十二、Cas9和Cas12a RNP电转常见问题

1. Cas9和Cas12a能够使用同一台电转仪吗？

在设备功能、耗材和目标细胞条件适配的情况下，可以评估使用同一台电转仪。但这不代表两种RNP体系已经具备相同的编辑效率。

2. Cas9电转成功后，Cas12a可以直接使用相同电压吗？

原有电脉冲程序可以作为候选参考，但不能直接认定已经适用。还需要验证Cas12a RNP编辑结果、细胞活率和设备输出状态。

3. Cas12a需要使用Cas9的sgRNA吗？

不需要。Cas12a通常采用与其蛋白相匹配的crRNA体系，不能直接将Cas9的向导RNA作为Cas12a向导RNA使用。

4. Cas12a一定比Cas9具有更高的基因编辑效率吗？

不能这样判断。不同核酸酶、蛋白变体、目标位点及细胞体系之间可能存在明显差异，必须结合实际实验数据比较。

5. Cas12a编辑率低，是不是应该增加RNP用量？

不建议直接增加。应先检查crRNA活性、Cas12a蛋白版本、RNP组装、细胞状态和递送结果。更多RNP不一定获得更好的编辑效果，还可能改变细胞耐受性。

6. 使用文献中的Cas12a脉冲程序，是否可以直接复制到其他品牌设备？

不能直接复制。不同设备的电极结构、波形控制和缓冲体系可能不同。应首先核对设备与耗材要求，再进行适当验证。

十三、Cas9与Cas12a RNP电转，应该验证体系而不是照搬参数

Cas9和Cas12a都属于可以通过电穿孔递送的CRISPR核酸酶，但其向导RNA结构、RNP组成、DNA识别及编辑表现存在差异。

对于已经建立成熟Cas9 RNP电转方案的实验室，切换Cas12a时，可以优先保留经过验证的细胞准备、设备耗材和恢复流程，将原有电脉冲程序作为候选起点，再独立检查Cas12a的crRNA活性、RNP体系及目标位点编辑结果。

如果原有设备已经满足所需电脉冲与反应耗材要求，就应该先评价是否能够适配，而不是直接更换仪器。

反之，如果现有设备在波形设置、参数控制、耗材或实际输出方面存在明确限制，就可以进一步评估其他电穿孔设备。

正在从Cas9 RNP切换到Cas12a RNP，遇到原有电转参数无法沿用、细胞活率下降、Cas12a编辑率低，或者不确定现有设备是否满足实验要求？

可以向威尼德提供目标细胞类型、现有电转仪型号、Cas9成功程序、计划使用的Cas12a版本以及实际实验需求，进一步沟通方波电转设备的功能、配套耗材和试机适配事项。

技术咨询电话：15532415159

相关设备：Gene Pulser 830方波电穿孔仪

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技术参考文献

• Zhang L, et al. AsCas12a ultra nuclease facilitates the rapid generation of therapeutic cell medicines. Nature Communications, 2021.

• Foss DV, et al. Peptide-mediated delivery of CRISPR enzymes for the efficient editing of primary human lymphocytes. Nature Biomedical Engineering, 2023.

• Increasing Gene Editing Efficiency via CRISPR/Cas9- or Cas12a-Mediated Knock-In in Primary Human T Cells. Biomedicines, 2024.

• Huang J, et al. CRISPR/Cas systems: Delivery and application in gene therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2022.

技术说明：本文用于Cas9和Cas12a RNP电转条件比较、实验方案评估及电穿孔设备选型参考。核酸酶版本、目标序列、细胞类型及设备平台均可能影响实际结果。文中涉及的科研研究数据不代表威尼德Gene Pulser 830的Cas12a实验实测结果；具体适配性应以产品技术资料及实验验证为准。