Cas9 RNP电转阳性对照如何设置？区分递送与编辑问题

在CRISPR/Cas9基因编辑实验中，有些研究人员已经完成Cas9 RNP电转，但后续检测发现目标位点编辑效率偏低，甚至没有检测到预期的基因组变化。

例如，某实验室使用电穿孔仪将Cas9 RNP递送到原代T细胞中，电转后细胞仍然能够存活，但目标基因的编辑比例很低。实验人员无法确定究竟是RNP没有有效进入细胞，还是进入细胞后没有完成预期的DNA切割。

面对这种情况，直接提高电转电压、增加Cas9蛋白或更换电转仪，都可能不是最合适的第一步。

Cas9 RNP电转失败排查的关键，是通过合理的阳性对照与阴性对照，区分分子递送、基因组编辑和细胞恢复这三个不同环节。

如果实验对照设计不完整，即使重新尝试多组电脉冲参数，也可能始终无法判断真正的限制因素。

一、Cas9 RNP电转，为什么需要设置阳性对照？

Cas9 RNP通常由Cas9蛋白和向导RNA（gRNA）组成。通过电穿孔技术，RNP复合物可以被递送进入目标细胞，并在适当条件下识别和切割特定DNA序列。

但Cas9 RNP电转并不是单一的实验过程，至少涉及以下三个阶段：

• 递送阶段：Cas9 RNP能否有效进入目标细胞。

• 编辑阶段：进入细胞的RNP能否在目标DNA位点产生预期编辑。

• 恢复阶段：细胞能否在电转后继续存活，并完成后续检测或功能研究。

如果只检测最终编辑效率，就很难判断失败发生在哪个阶段。

例如，目标位点没有出现明显Indel，可能是RNP递送不足，也可能是gRNA活性偏低、目标序列与设计不符，或者检测时间及分析方法不合适。

因此，阳性对照的作用并不是简单证明电转仪能够放电，而是为判断当前RNP编辑体系是否正常提供参考。

图1：Cas9与gRNA识别目标DNA并产生切割的机制示意。RNP进入细胞后，还需要完成靶点识别及编辑。图片：Mariuswalter / Wikimedia Commons，CC BY-SA 4.0。

二、Cas9 RNP电转应该设置哪些对照组？

对于尚未建立稳定RNP电转方案的实验室，建议根据实际研究目的，合理选择未处理对照、空脉冲对照、非靶向RNP对照和已验证编辑阳性对照。

需要说明，空脉冲对照通常指细胞经过约定的电转相关处理和电脉冲程序，但不加入具有编辑活性的Cas9 RNP。具体组成应在实验记录中明确。

上述各组并不一定需要在每轮实验中全部设置，应根据实验阶段、样本数量和已有验证资料决定。

三、真正的编辑阳性对照应该怎样选择？

对于Cas9 RNP电转，较有价值的编辑阳性对照通常是已经在相应细胞体系中验证过、能够产生稳定可检测编辑结果的Cas9 RNP组合。

选择时应重点考虑三个条件。

1. gRNA活性已经得到验证

阳性对照所使用的gRNA，应尽量具有相关细胞或接近实验条件下的编辑证据。

如果直接使用一条未经验证的gRNA作为阳性对照，当实验失败时，就无法区分问题来自gRNA本身还是递送过程。

2. 目标位点能够可靠检测

阳性对照最好具有明确的检测方法，例如经过验证的靶位点扩增测序，或者适用的蛋白表达检测。

如果选择通过流式细胞术观察表面蛋白变化，需要确认目标蛋白在当前细胞中正常表达，并考虑蛋白周转带来的检测时间差异。

3. 尽可能与当前研究细胞匹配

例如，针对小鼠T细胞已经验证的CD90编辑对照，不应直接作为人原代T细胞的通用阳性对照。

不同物种、细胞类型和目标序列可能存在差异。即使基因名称相同，也应核对gRNA与相应参考基因组的匹配情况。

2018年发表于《Journal of Experimental Medicine》的研究，在小鼠原代T细胞中利用Cas9 RNP电转编辑CD90、CTLA4和PD1等目标，分别评价RNP递送、细胞活率和基因敲除结果。

这项研究说明，使用能够检测的目标位点作为编辑参考，并同时评价细胞状态，有助于比较不同RNP电转条件。

但文献中成功使用的靶点和程序不能直接作为所有细胞的标准阳性对照。

四、荧光标记RNP阳性，能证明Cas9编辑成功吗？

不能。

部分研究采用荧光标记的tracrRNA、gRNA或Cas9蛋白，辅助观察相关编辑组分的递送情况。

例如，在适当的RNP体系中，研究人员可以通过荧光检测获得递送相关信号，再结合目标位点测序或蛋白检测分析编辑结果。

但是，荧光信号只能提供递送相关证据，不能直接代替基因编辑检测。

为什么有荧光信号，编辑率却可能很低？

常见原因包括：

• 检测到的荧光不一定全部代表具有活性的完整RNP；

• 部分荧光可能来自细胞表面结合或其他非特异性信号；

• 递送的RNP可能未能有效到达或作用于目标DNA；

• 当前gRNA与目标序列的匹配或编辑活性不足；

• 细胞状态和检测条件可能影响最终编辑结果。

因此，荧光示踪实验应配置适当的阴性对照、细胞门控及背景判断方法。

还需要明确，单纯使用GFP质粒观察细胞转染阳性率，并不能直接证明Cas9 RNP的递送效率。质粒DNA与蛋白-RNA复合物在分子结构和递送行为方面存在明显差异。

五、流式细胞术怎样辅助判断RNP递送？

在适合使用荧光示踪的研究体系中，流式细胞术可用于分析细胞群体的荧光分布。

分析时应注意区分目标细胞、活细胞及荧光阳性群体，避免将死细胞或明显的非特异性信号纳入结果。

如果通过目标表面蛋白下降评价基因敲除，还需要使用经过验证的抗体和合理的检测时间。

图2：流式细胞术荧光门控示例。该图用于说明荧光阳性与阴性群体的区分方法，并非Cas9 RNP实验实测数据。图片：Extrabodyprosím / Wikimedia Commons，CC BY-SA 4.0。

特别需要注意，荧光阳性比例、目标蛋白阴性比例和基因组编辑比例属于不同指标，不能在实验报告中混为一谈。

六、RNP递送正常但编辑失败，应该检查哪些因素？

如果已有合理证据提示RNP相关组分进入了细胞，但目标位点编辑结果仍然偏低，应优先检查以下问题。

1. gRNA设计与目标序列是否一致

需要确认gRNA是否针对正确的物种、基因组版本和目标位点，并检查当前细胞是否存在可能影响识别的序列差异。

2. Cas9 RNP是否具有预期活性

可以结合已验证阳性对照的表现，判断Cas9蛋白、gRNA及相关RNP组分是否存在异常。

如果目标RNP编辑失败，而阳性对照正常，应优先分析目标gRNA与靶位点相关因素。

3. 是否采用合适的编辑检测方法

如果目标是检测DNA插入缺失突变，应使用适当的靶位点基因组检测方法。

如果通过目标蛋白表达下降判断敲除，则还需要考虑蛋白稳定性、突变类型和细胞群体组成。

尤其是早期蛋白检测没有明显变化时，不能直接判断Cas9未完成DNA编辑。

4. 细胞是否能够完成编辑及后续恢复

某些细胞在RNP递送以后，可能出现活率下降或增殖异常。

因此，除了记录编辑百分比，还应关注实际活细胞回收量，以及编辑后的细胞能否满足后续研究需求。

七、阳性对照也没有编辑结果，是否说明电转仪存在问题？

不一定。

如果目标RNP和已验证的阳性对照均未能产生预期编辑，可以将排查范围扩展到共同使用的实验环节。

例如：

• 当前细胞的来源、活率及培养状态；

• Cas9蛋白和gRNA的质量及保存情况；

• RNP体系是否按照经过验证的方法准备；

• 电转杯、电转缓冲液和样品体积是否匹配；

• 设备是否正常完成预设脉冲；

• 电转后恢复和基因编辑检测是否正常。

如果阳性对照在其他已验证条件下能够正常编辑，但更换设备或电脉冲程序后失败，就值得进一步核对设备适配性。

反之，如果阳性对照的gRNA或检测方法本身未经验证，单次失败不足以判断电转仪存在问题。

八、如何通过检测结果快速判断问题方向？

上述判断只能用于确定优先排查方向，并不代表某一种实验现象只能由单一原因造成。

如果涉及样本珍贵的原代细胞，可以优先利用已经积累的对照数据缩小问题范围，避免重新进行大规模参数筛选。

九、编辑效率应该怎样检测，才能让阳性对照真正发挥作用？

编辑阳性对照不仅需要有明确的实验组，还需要采用能够可靠识别编辑结果的检测方法。

1. 靶位点Sanger测序

对于部分CRISPR实验，可以对目标位点进行PCR扩增和Sanger测序，再利用适当的软件分析混合序列信号，估算插入缺失情况。

但需要注意，相关软件估算结果受到序列质量、参考对照和突变复杂程度等因素影响。

2. 靶向高通量测序

如果需要分析多种Indel类型、较低比例的特定编辑或者更复杂的编辑结果，可以根据研究要求考虑靶向高通量测序。

不同方法具有各自的检测范围和局限，不应仅以是否得到一个编辑百分比作为方法是否可靠的判断依据。

3. 蛋白检测和功能检测

对于基因敲除实验，流式细胞术或Western blot可以提供目标蛋白表达方面的证据。

如果研究最终关注细胞功能，还应进一步结合实际项目选择功能检测。

图3：Sanger测序峰图示例，用于说明DNA序列检测的基本数据形式，并非本实验的CRISPR编辑结果。图片：Tom David / Wikimedia Commons，公共领域。查看图片来源。

合理的阳性对照应当有明确的检测终点。如果阳性对照设计用于验证DNA编辑，就应优先检测目标位点的基因组变化，而不是只依据荧光递送信号判断成功。

十、Cas9 RNP阳性对照实验，需要记录哪些数据？

为了方便后续比较和故障排查，建议建立相对统一的实验记录。

这些信息可以帮助实验室在更换RNP批次、细胞来源或电脉冲条件以后，判断结果变化是否与某个具体因素有关。

对于长期开展基因编辑的研究平台，积累可追溯的阳性对照记录，也有助于减少每次实验都从头判断设备和编辑体系是否正常的情况。

十一、Cas9 RNP电转阳性对照实验，如何选择电穿孔仪？

对于已经明确采用方波进行Cas9 RNP递送的实验室，可以评估威尼德Gene Pulser 830方波电穿孔仪。

根据威尼德产品资料，Gene Pulser 830主要面向哺乳动物细胞、悬浮细胞及原代细胞等真核细胞电转应用。

设备具有以下功能：

• 方波脉冲输出，可独立调节脉冲强度和时间；

• 支持多脉冲时间及间隔组合；

• 可显示实际电压、脉冲时间及波形曲线；

• 支持预脉冲样品电阻测量；

• 具备电弧保护及异常放电安全保护功能；

• 支持600条实验方案存储和100条历史记录查询。

这些功能的实际价值在于，研究人员可以保存和比较不同RNP电转程序，并在阳性对照结果异常时核对设备运行情况。

图4：威尼德Gene Pulser 830方波电穿孔仪。实际电脉冲与运行记录可辅助分析不同RNP实验条件之间的差异。

需要明确，Gene Pulser 830能够提供方波电脉冲和运行记录，但不能直接检测Cas9 RNP是否进入细胞，也不能自动测定目标基因编辑效率。

具体实验是否适配，仍然需要结合目标细胞、RNP体系、配套耗材及试机验证结果判断。

十二、Cas9 RNP电转阳性对照常见问题

1. 可以使用GFP质粒作为Cas9 RNP阳性对照吗？

GFP质粒可以用于评价相应质粒递送与表达体系，但不能直接替代Cas9 RNP编辑阳性对照。两者递送材料和实验终点不同。

2. 非靶向gRNA属于阳性对照还是阴性对照？

通常作为阴性对照使用，帮助判断RNP处理背景。它不针对研究目标位点，因此不能用于证明目标基因编辑成功。

3. 使用荧光标记tracrRNA后，能直接计算Cas9编辑效率吗？

不能。荧光信号提供递送相关信息，基因编辑效率仍需要根据目标位点DNA变化或经过验证的其他方法进行评价。

4. 阳性对照成功，是否代表目标gRNA一定有效？

不一定。阳性对照只能说明相关实验体系具备产生可检测编辑的能力，其他gRNA仍然需要独立验证。

5. 阳性对照失败，需要立即更换电转仪吗？

不一定。应先核对细胞、RNP试剂、检测流程及实际电脉冲记录。只有确认设备无法满足相应递送要求时，才有必要进一步评估设备更换。

十三、Cas9 RNP电转排查，关键是让每个对照回答一个明确问题

Cas9 RNP电转实验中，阳性对照的价值不只是证明某条gRNA可以编辑，而是帮助研究人员判断整个实验链条是否正常。

如果递送相关信号正常，但基因组编辑不足，应重点排查RNP活性、靶点和检测方法。

如果经过验证的阳性对照和目标RNP均无法获得预期结果，就需要进一步检查细胞状态、递送体系及设备适配性。

如果DNA编辑已经符合要求，但电转后细胞无法正常恢复，则应结合实际活细胞回收量评价实验条件。

对照设计越清楚，就越容易减少无效参数尝试，也越有利于判断是否真正需要更换电转设备。

正在开展T细胞、NK细胞或其他哺乳动物细胞Cas9 RNP电转，遇到阳性对照失败、递送效率不明确、编辑结果波动或者电脉冲参数难以复现的问题？

可以向威尼德提供细胞类型、当前使用的电转仪型号、RNP体系、阳性对照结果和目标基因编辑数据，进一步沟通方波电转设备的脉冲功能、运行记录及试机适配需求。

技术咨询电话：15532415159

相关设备：Gene Pulser 830方波电穿孔仪

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技术参考资料

• Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. Journal of Experimental Medicine, 2018.

• Addgene：Plasmids 101 - Control Plasmids.

• Addgene：CRISPR 101 - Validating Your Genome Edit.

技术说明：本文用于Cas9 RNP电转对照设计、基因编辑检测及设备适配研究参考。不同细胞和gRNA组合的阳性对照应依据实际验证结果确定。荧光递送信号不等于真实编辑效率，设备输出记录也不能替代基因组检测。具体实验结论应以经过验证的数据为准。