Cas9 RNP电转后单克隆建立失败，如何排查？

在CRISPR/Cas9基因编辑实验中，有些研究人员已经通过Cas9 RNP电转获得了较高的目标位点编辑比例，但在后续单细胞分选、克隆培养和基因型筛选阶段，却遇到了新的问题。

例如，实验室使用Cas9 RNP电转处理某种哺乳动物细胞，靶位点测序结果显示基因已经发生编辑。但将细胞分配到96孔板进行单克隆培养以后，部分孔始终没有细胞增殖，部分克隆在传代过程中死亡，最终能够获得的目标基因型克隆数量很少。

这时，研究人员容易怀疑：是不是电转电压过高？Cas9 RNP递送是否损伤了细胞？是否需要重新调整电转参数？

事实上，Cas9 RNP电转成功与单克隆建立成功属于两个不同的实验阶段。DNA编辑效率较高，不代表细胞一定具有良好的单细胞存活和克隆扩增能力。

因此，遇到单克隆建立失败时，需要区分电转损伤、细胞恢复、单细胞分离、克隆培养及目标基因编辑本身的影响，再决定应该优化哪个环节。

一、Cas9 RNP电转成功，为什么单克隆仍然建立失败？

Cas9 RNP由Cas9蛋白和向导RNA组成，通过电穿孔递送进入细胞后，可以在目标DNA位点产生编辑。

但对于需要建立稳定基因敲除细胞株的研究，电转只是整个流程的前端步骤。

通常还需要经过细胞恢复、群体编辑效率检测、单细胞分离、克隆培养、基因型鉴定以及必要的蛋白和功能验证。

在这一过程中，每个阶段都有可能影响最终获得的单克隆数量。

例如，某组细胞在电转后仍然具有较高的短期活率，但单细胞分离后增殖能力较弱；也可能细胞能够形成克隆，却无法筛选到具有预期基因型的细胞。

因此，应当区分三个不同指标：

• 电转后细胞活率：评价细胞在电转及恢复阶段的存活情况。

• 单克隆形成能力：评价单个细胞能否存活、分裂并形成可扩增的细胞群。

• 目标克隆获得率：评价最终能否获得经过验证、具有预期基因型的单克隆。

这三个指标不能相互替代，也不能单纯根据其中一项判断电转仪是否适配。

图1：CRISPR基因编辑后传统单克隆分离与半自动单细胞克隆流程对比。图片来源：Frank等，Stem Cell Research & Therapy，2023，原始研究，CC BY 4.0。

二、原因1：电转后细胞存活，但恢复能力不足

电穿孔利用电脉冲暂时改变细胞膜通透性，使Cas9 RNP等分子进入细胞。

这一过程可能影响细胞膜完整性及后续恢复状态。

部分细胞在电转结束后能够通过活率检测，但在继续培养或进入单细胞分离阶段时，可能出现增殖减慢、细胞损失增加等情况。

为什么短期活率正常仍然可能影响克隆形成？

细胞活率检测通常反映特定时间点的细胞状态，而单克隆建立要求单个细胞能够继续存活并完成多轮分裂。

因此，电转后细胞活率较高，不代表细胞的长期增殖能力完全不受影响。

如果出现这一情况，建议优先核对：

• 电转前细胞的培养状态和基础活率；

• 所使用的电脉冲程序及实际输出记录；

• 电转缓冲液与电极耗材是否适配；

• 电转后细胞恢复与培养条件；

• 细胞是否具有继续增殖的能力。

如果多个不同RNP体系的电转细胞都出现类似的恢复问题，可以进一步检查电转和培养流程。

但如果只有特定基因编辑组无法恢复，则还需要考虑目标基因本身的作用。

三、原因2：细胞本身不适合直接进行单细胞培养

不同细胞类型对单细胞分离和培养的耐受能力存在差异。

部分常用肿瘤细胞系具有较强的增殖能力，而一些原代细胞及人多能干细胞，对单细胞解离和低密度培养更为敏感。

1. 单细胞分离可能带来额外应激

单细胞分离可能破坏细胞之间以及细胞与细胞外基质之间的相互作用。

对于部分依赖细胞间连接或基质支持的细胞，单细胞化以后可能出现失巢凋亡或其他应激反应。

这意味着，某些细胞在普通群体培养中能够增殖，但独立分离成单细胞后，却难以继续生长。

2. 细胞培养体系可能不支持克隆扩增

单细胞培养与普通细胞培养的需求不一定完全相同。

例如，人多能干细胞的单细胞克隆建立，通常需要特别考虑培养基、基质及细胞存活支持条件。

已有研究采用经过验证的培养支持策略改善特定干细胞体系的单细胞存活，但不能直接推广到所有细胞类型。

3. 原代T细胞不一定适合常规稳定细胞株建系流程

部分原代免疫细胞的培养、扩增和长期维持受到细胞状态及实验体系限制。

对于仅需要分析群体基因编辑或短期细胞功能的项目，不一定必须建立长期稳定的单克隆细胞株。

因此，实验开始前应先明确：研究目标究竟需要单细胞来源的稳定克隆，还是经过验证的编辑细胞群体即可满足要求。

四、原因3：单细胞分选方法影响细胞存活与克隆纯度

建立CRISPR编辑单克隆时，常见的细胞分离方式包括有限稀释、流式细胞分选及其他单细胞分离平台。

不同方法具有不同特点，也可能引入额外的细胞损耗。

1. 有限稀释法

有限稀释法通过降低细胞悬液浓度，使部分培养孔获得单个细胞。

这种方法所需设备相对简单，但单个培养孔实际获得的细胞数量存在统计波动。

因此，某个培养孔最终出现一个细胞克隆，并不能单凭结果证明它最初一定由一个细胞形成。

2. 流式单细胞分选

流式细胞分选可以根据细胞荧光和散射特征选择目标细胞，并将细胞分配到指定培养孔。

但分选过程中的机械应力、分选液环境和操作时间，也可能影响部分敏感细胞的存活。

因此，细胞分选以后出现大量死亡时，应检查分选过程和培养恢复条件，而不是全部归因于之前的电转。

3. 影像记录与单克隆来源确认

如果研究需要证明克隆来源于单个细胞，可以通过适当的单细胞分离平台及连续影像记录，提高克隆来源判断的可靠性。

尤其是要求严格的稳定细胞株研究，单克隆来源确认与后续基因型鉴定应当分别完成。

图2：研究人员通过微孔板及影像记录追踪人多能干细胞单克隆的形成和扩增。图片来源：Frank等，Stem Cell Research & Therapy，2023，原始研究，CC BY 4.0。

五、原因4：目标基因编辑影响细胞的存活或增殖

这是CRISPR单克隆筛选中另一个容易被忽略的问题。

如果目标基因参与细胞存活、增殖或细胞周期调控，那么成功破坏该基因后，细胞本身就可能失去正常扩增能力。

例如，某个基因对当前细胞的存活具有重要作用，那么未编辑细胞可能继续增殖，而真正完成该基因功能敲除的细胞可能难以形成稳定克隆。

这种情况下，即使电转条件正常、细胞分选方法合理，也可能长期无法获得预期基因型的克隆。

因此，应当比较未编辑对照、单细胞分离对照及编辑细胞的增殖表现。

如果只有目标基因编辑组出现明显克隆形成障碍，就需要结合该基因已知功能进一步分析。

不能把无法获得目标基因敲除克隆，直接认定为电穿孔效率不足。

六、为什么形成了细胞克隆，却筛选不到目标基因型？

有些实验室并不是完全无法形成克隆，而是建立了多个单克隆以后，基因型检测结果却不符合预期。

这种情况需要与细胞无法存活的问题分开分析。

1. 初始群体编辑效率不足

如果电转后的混合细胞群体中，真正具有预期编辑的细胞比例较低，那么后续单克隆筛选也可能需要检测大量候选克隆。

因此，在正式开展单细胞克隆培养以前，建议先利用适当方法评估群体水平的编辑结果。

2. Indel不一定代表功能性敲除

部分插入缺失突变可能没有破坏蛋白编码阅读框，或者没有影响关键蛋白功能。

因此，即使检测到基因组编辑，也需要分析突变类型、等位基因组成及必要的蛋白表达结果。

3. 克隆筛选可能产生生长偏倚

具有某些基因型的细胞可能增殖较快，而其他编辑细胞增殖较慢。

经过单细胞分离和多轮培养以后，最终获得的克隆组成可能与最初电转后的混合群体不同。

因此，不能仅根据最终获得的克隆比例，反推原始群体中各种编辑类型的实际分布。

七、单克隆建立失败，怎样快速确定问题发生在哪个阶段？

相比反复更换电转程序，更有效的方式是按照实验阶段逐步排查。

通过这种方式，可以先明确真正发生异常的阶段，再选择相应的验证方法。

如果电转后群体细胞恢复正常，但所有单细胞培养组都无法扩增，应优先检查克隆培养体系，而不是直接重新优化电压。

八、Cas9 RNP电转后，单克隆建立可以怎样评价？

对于计划建立稳定编辑细胞株的实验室，建议记录以下指标。

如果只记录最终获得了多少个克隆，就可能无法判断损失主要发生在电转阶段、分选阶段还是后续培养阶段。

对于需要长期使用的细胞株，还应根据研究要求开展细胞身份、污染情况以及必要的遗传稳定性检查。

九、什么时候需要重新评估Cas9 RNP电转仪？

并不是所有单克隆建立失败都需要更换电转设备。

如果问题主要出现在单细胞培养阶段，应优先检查细胞分离与培养方法。

但如果电转后细胞损伤明显，或者在确认RNP和细胞状态正常的情况下始终无法建立可接受的编辑结果，则可以进一步评估电转设备及电脉冲条件。

Gene Pulser 830方波电穿孔仪

对于采用方波方式开展哺乳动物细胞Cas9 RNP电转的实验室，可以了解威尼德Gene Pulser 830方波电穿孔仪。

根据产品技术资料，Gene Pulser 830具有以下功能：

• 方波脉冲输出，支持脉冲强度与时间调节；

• 支持多脉冲组合设置；

• 可查看实际电脉冲参数和波形；

• 支持预脉冲样品电阻测量；

• 具备电弧保护和异常放电相关保护功能；

• 支持实验程序保存与历史记录查询。

对于需要进一步开展单克隆筛选的CRISPR实验，这些功能可以帮助研究人员记录电转条件、检查实际输出并比较不同实验批次。

图3：威尼德Gene Pulser 830方波电穿孔仪，可用于符合设备条件的细胞RNP电转方案开发及实验验证。

需要说明，Gene Pulser 830负责电穿孔递送环节，并不是单细胞分选设备，也不具备直接保证单克隆形成的功能。

如果电转后细胞恢复良好，但进入单细胞分离阶段以后大量死亡，应优先检查细胞克隆培养条件，而不是将问题全部归因于电转仪。

十、Cas9 RNP电转后单克隆建立常见问题

1. 电转后细胞活率正常，为什么单克隆形成率仍然低？

短期活率与单细胞长期增殖能力不同。需要进一步检查单细胞分离、培养支持条件、细胞类型及目标基因编辑本身的影响。

2. 单克隆建立失败，是否应该直接提高电转电压？

不建议直接这样处理。如果电转后群体编辑率已经符合要求，应先排查细胞恢复和单克隆培养。提高电压可能增加损伤，却不一定改善克隆形成。

3. 96孔板中只长出一个克隆，就一定属于单细胞来源吗？

不一定。有限稀释存在统计分配差异，应结合起始单细胞确认、影像记录或其他合适证据判断克隆来源。

4. 筛选不到双等位基因敲除克隆，是电转失败吗？

不一定。还可能与初始编辑比例、基因拷贝数、等位基因结构以及目标基因对细胞增殖和存活的影响有关。

5. 原代T细胞CRISPR实验一定需要建立单克隆吗？

不一定。如果研究目标可以通过经过验证的编辑细胞群体完成，就不必机械采用稳定单克隆细胞株的研究流程。具体应根据实验终点决定。

十一、单克隆建立失败，关键是先找到真正的限制环节

Cas9 RNP电转后单克隆建立失败，并不意味着前面的基因编辑一定失败。

实验人员需要区分：电转是否导致过度细胞损伤、单细胞分选是否影响存活、培养体系是否支持克隆扩增，以及目标基因编辑是否改变细胞的增殖能力。

如果问题主要来自电转阶段，就应重点检查脉冲输出、细胞状态、缓冲体系及恢复条件；如果问题发生在单细胞分离和克隆培养阶段，就需要把优化重点转移到相应环节。

对于希望建立稳定基因敲除细胞株的实验室，建议将群体编辑效率、细胞存活、克隆形成和最终基因型作为相互独立但有关联的评价指标。

正在开展Cas9 RNP电转和基因敲除细胞株研究，遇到电转后细胞大量死亡、编辑效率不足或者不同批次脉冲条件难以复现的问题？

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相关技术文章：基因编辑电转为什么要重视实验可追溯性？

技术参考文献

• Addgene：CRISPR Guide

• Addgene：CRISPR 101 - Validating Your Genome Edit

• Ammar，2025：Single-cell cloning and its approaches

• Frank等，2023：Semi-automated optimized method to isolate CRISPR/Cas9 edited human pluripotent stem cell clones

技术说明：本文为Cas9 RNP电转、基因编辑单克隆筛选及设备适配的研究参考。单克隆形成能力与细胞类型、分选方式、培养条件及目标基因功能有关。具体实验结果应以相应检测和验证数据为准，不对特定电转设备的单克隆形成率作出保证。