CRISPR RNP基因敲除成功，为什么目标蛋白仍有表达？

在CRISPR/Cas9基因编辑实验中，有些研究人员已经通过Cas9 RNP电转完成目标基因编辑，并在基因组测序中检测到较高比例的插入缺失突变（Indel），但后续进行流式细胞术或Western blot检测时，却发现目标蛋白仍然存在。

例如，实验室采用Cas9 RNP电转对原代T细胞中的某个受体相关基因进行敲除，DNA测序显示目标位点已经发生编辑，但流式细胞术仍然能够检测到对应的细胞表面蛋白。

这时，研究人员可能怀疑电转仪递送效率不足、gRNA活性不够，或者原来的电脉冲参数不适合当前细胞。

但实际上，CRISPR RNP电转后检测到DNA编辑，并不意味着目标蛋白一定立即消失，也不能仅凭Indel比例判断功能性基因敲除已经完成。

目标蛋白仍有表达，可能与原有蛋白尚未降解、基因等位基因未完全失活、阅读框内突变、替代剪接、翻译重新起始以及检测方法等因素有关。

因此，出现基因型与蛋白表达结果不一致时，首先应明确检测对象和检测时间，再针对不同原因开展验证。

一、CRISPR RNP基因编辑成功，为什么不等于蛋白敲除成功？

Cas9 RNP通常由Cas9蛋白和向导RNA组成，通过电穿孔递送进入细胞后，可以识别并切割特定DNA序列。

细胞利用自身DNA修复机制修复断裂位点时，可能产生碱基插入或缺失，从而改变原有基因序列。

但Indel并不一定导致基因功能完全丧失。

如果突变没有破坏关键蛋白结构，或者细胞仍然保留能够正常表达的基因等位基因，就可能继续检测到目标蛋白。

因此，CRISPR基因敲除至少需要区分三个不同的评价层面：

• DNA编辑：目标基因组位点是否发生预期的序列变化。

• 蛋白表达：目标蛋白的表达水平是否下降或消失。

• 生物学功能：相关蛋白功能或细胞表型是否发生预期改变。

这三个指标具有联系，但不能相互替代。

图1：CRISPR/Cas9产生DNA双链断裂后，可通过不同修复途径形成基因组变化。DNA编辑不一定等于蛋白功能完全丧失。图片来源：Mjeltsch / Wikimedia Commons，CC BY-SA 4.0。

二、原因1：基因已经编辑，但原有蛋白尚未降解

这是CRISPR RNP基因敲除实验中容易忽视的情况。

即使Cas9已经破坏了目标基因的功能，细胞中原有的蛋白也不会因为DNA发生编辑而立即消失。

不同蛋白具有不同的稳定性、降解速度及细胞内定位。

部分蛋白更新较快，基因敲除以后可以较早观察到表达下降；而某些相对稳定的细胞表面蛋白或胞内蛋白，可能需要更长时间才能观察到明显变化。

已有研究提供了什么证据？

2021年发表于《PLOS Pathogens》的一项原代人B细胞研究，利用Cas9 RNP编辑CD46基因，并分别检测基因组编辑与细胞表面CD46蛋白的变化。

研究发现，基因组层面的编辑较早就可以检测到，但蛋白表达的下降存在明显时间差。

在该研究的具体实验条件下，电转后24小时约有10%的细胞表现为CD46阴性，而到第8天，CD46阴性细胞比例超过85%。

这说明对于部分蛋白，DNA编辑发生的时间与蛋白表达变化的时间并不一致。

需要注意，这些数据只适用于该研究的细胞和实验条件，不能推断所有目标蛋白都需要相同时间才能下降。

图2：原代B细胞CD46基因编辑与蛋白表达变化的研究数据。图片来源：Akidil等，PLOS Pathogens，2021，CC BY 4.0。查看原始研究。

应该如何判断是否属于蛋白残留？

如果DNA编辑已经得到验证，但蛋白水平尚未明显下降，可以结合目标蛋白的已知稳定性，在适当的不同时间点进行检测。

同时，应记录细胞培养状态、增殖情况及检测方法，避免把不同条件下的结果直接比较。

不建议仅因为早期蛋白表达没有消失，就直接增加电转电压或重新开展整个参数筛选。

三、原因2：检测到Indel，但目标基因没有完全失活

Cas9切割以后，细胞可能产生不同类型的插入或缺失突变。

其中，有些突变会改变蛋白编码阅读框，可能导致提前终止翻译；有些突变则没有改变整体阅读框。

1. 阅读框内突变可能保留蛋白功能

如果编码区域中的插入或缺失长度为3的整数倍，通常不会改变后续密码子的阅读框。

这类突变可能使蛋白缺少或增加少量氨基酸，但不一定导致蛋白完全失活。

因此，即使测序检测到明显的Indel，也需要分析突变的具体序列、位置，以及是否影响关键结构域。

2. 只编辑部分等位基因

对于具有多个基因拷贝的细胞，目标位点可能只有部分等位基因发生功能破坏。

例如，在通常具有两个等位基因的二倍体细胞中，如果只有其中一个等位基因失活，另一个仍然能够正常表达，就可能继续检测到目标蛋白。

某些肿瘤细胞系还可能具有异常染色体数目或额外基因拷贝，不能简单假设其目标基因只有两个拷贝。

3. 群体测序结果不等于每个细胞的基因型

假设某次实验的整体Indel比例较高，也不能据此认定所有细胞都已经发生完整的功能性基因敲除。

群体中可能同时存在野生型细胞、单等位基因编辑细胞、双等位基因编辑细胞，以及具有不同突变类型的细胞。

如果研究必须确认某个细胞克隆已经完全失活，就需要采用适合的基因型分析方法进行验证。

四、原因3：替代剪接或翻译重新起始，导致蛋白仍然存在

部分CRISPR基因敲除研究发现，即使目标位点产生了移码突变，细胞仍然可能表达某些残余蛋白。

2019年发表于《Nature Methods》的研究系统分析了193个具有CRISPR移码突变的基因敲除细胞模型，发现部分模型仍存在残余蛋白表达。

研究人员指出，替代剪接和翻译重新起始是其中的重要机制。

1. 替代剪接可能跳过被编辑的外显子

某些基因编辑可能影响RNA剪接，使成熟mRNA跳过相关外显子。

如果新的转录本仍然可以产生具有一定功能的蛋白，就可能在DNA发生编辑后继续检测到表达。

2. 翻译重新起始可能产生截短蛋白

在部分情况下，细胞可能利用下游的翻译起始位置产生缺少N端区域的蛋白。

如果该截短蛋白仍包含检测抗体所识别的表位，Western blot等检测方法可能继续观察到相应信号。

部分截短蛋白还可能保留一定生物学功能。

因此，如果已经确认发生移码突变，但蛋白依然存在，可以进一步分析mRNA剪接、蛋白分子量及抗体识别区域，而不是仅重复原有DNA测序。

五、原因4：蛋白检测方法或抗体选择影响了结果判断

在CRISPR基因敲除验证中，不同检测方法可能得到不同形式的结果。

1. Western blot检测需要关注蛋白条带

如果目标蛋白没有完全消失，应观察条带分子量是否发生变化，并检查是否存在截短蛋白或其他蛋白异构体。

还需要确认抗体的识别区域，以及该抗体是否适合当前样品和检测方法。

2. 流式细胞术需要关注细胞群体

对于细胞表面蛋白，可以通过流式细胞术比较编辑组与对照组的阳性细胞比例及荧光强度。

但分析时应保持死细胞排除、补偿设置、门控策略及阴性阈值的一致性。

如果编辑后细胞发生明显表型变化，原有门控方式也需要重新核查其适用性。

3. mRNA下降不代表蛋白立即消失

RT-qPCR或RNA测序可以提供转录本水平的信息，但mRNA表达变化与蛋白表达变化并不一定同步。

特别是在存在替代转录本、不同蛋白异构体或蛋白稳定性差异的情况下，需要结合蛋白检测结果判断。

六、基因型和蛋白表达结果不一致，建议怎样排查？

当Cas9 RNP电转后出现DNA编辑阳性、目标蛋白仍然表达的情况，可以先根据检测结果缩小问题范围。

如果检测时间、基因型及抗体特异性尚未确认，就不应直接把问题归因于电脉冲参数。

七、如何设计CRISPR基因敲除的验证流程？

对于希望获得可靠功能性基因敲除结果的实验室，可以将验证工作分为三个层面。

第一步：确认DNA编辑

通过适当的靶位点扩增测序等方法，确认是否发生目标基因组编辑，并分析具体的插入或缺失类型。

对于需要确定完整基因型的项目，应进一步考虑等位基因组成、突变位置和细胞克隆情况。

第二步：确认蛋白表达变化

根据目标蛋白的位置及性质，选择合适的流式细胞术、Western blot或其他蛋白检测方法。

检测时间应参考蛋白稳定性和细胞培养状态，而不是对所有CRISPR实验统一采用相同时间点。

第三步：确认生物学功能

如果实验目标是研究某个基因的功能，就需要根据研究目的进一步评价对应的细胞表型或功能变化。

例如，某些免疫细胞研究不仅需要检测受体蛋白表达，还需要确认相关信号或细胞功能是否发生预期改变。

需要注意，蛋白表达降低本身不一定能证明全部目标功能均已消失，而功能改变也可能受到其他细胞状态变化影响。

八、什么情况下应该重新检查Cas9 RNP电转设备？

虽然目标蛋白仍然表达不一定是电转仪问题，但当实验在DNA层面就出现编辑不足时，仍然需要评估RNP递送及电脉冲条件。

以下情况值得进一步检查设备端：

• 目标位点始终无法获得可接受的基因组编辑结果；

• 使用经过验证的RNP对照，仍然出现明显的编辑不足；

• 不同实验批次使用相同设定参数，但实际脉冲输出发生异常；

• 电转过程中出现异常放电或样品状态异常；

• 电转后细胞损伤明显，导致无法获得足够的有效编辑细胞。

此时应结合细胞来源、RNP质量、缓冲体系、电转耗材及设备记录进行综合判断。

如果DNA编辑已经达到预设要求，只是蛋白尚未下降，应优先检查蛋白检测时间、突变性质及表达机制，而不是直接增加电转强度。

九、Cas9 RNP电转设备选型：Gene Pulser 830

对于正在开展哺乳动物细胞、原代T细胞或其他真核细胞Cas9 RNP电转的实验室，可以根据实际脉冲需求评估威尼德Gene Pulser 830方波电穿孔仪。

根据威尼德产品资料，Gene Pulser 830支持方波脉冲输出，可独立设置脉冲强度和持续时间，并具有多脉冲组合功能。

设备可以显示实际脉冲电压、时间及波形，并支持预脉冲电阻测量、异常放电保护、实验方案保存及历史记录查询。

对于需要比较不同电转条件的实验室，这些功能有助于核对设备运行状态并保存相关记录。

图3：威尼德Gene Pulser 830方波电穿孔仪，可用于符合设备要求的细胞电转条件开发及参数记录。

需要明确，电转仪能够提供电脉冲递送能力，但不能直接决定目标蛋白的降解速度、RNA剪接方式或者基因突变后的蛋白功能。

因此，设备适配性应该通过基因组编辑结果、细胞存活和重复性等指标判断，不能仅以某个时间点的蛋白阴性比例评价设备性能。

十、CRISPR RNP基因敲除后蛋白仍表达的常见问题

1. Cas9 RNP编辑成功后，目标蛋白多久会消失？

没有适用于所有蛋白的统一时间。不同蛋白的半衰期、细胞定位和更新速度不同，应结合目标蛋白特性及实际研究结果确定检测时间。

2. 测序检测到较高Indel比例，就代表基因完全敲除了吗？

不一定。Indel可能包括阅读框内突变，也可能只影响部分基因等位基因。需要进一步分析具体基因型及蛋白功能。

3. Western blot仍然有条带，是不是电转失败？

不能直接判断。应结合DNA测序、条带分子量、抗体识别区域及蛋白检测时间分析。

4. 目标蛋白表达不下降，是否应该增加电转电压？

不建议直接增加。首先应确认目标DNA是否已经有效编辑。如果基因组编辑正常，应优先排查蛋白层面的原因。

5. 能否只用流式细胞术判断CRISPR基因敲除成功？

对于部分具有明确表面蛋白的研究，流式检测可以提供重要证据。但如果需要准确确认基因型，应进一步采用适当的基因组检测方法。

十一、CRISPR RNP基因敲除，应该建立完整的验证标准

CRISPR RNP电转后，基因组编辑成功和目标蛋白表达消失并不是完全同步的事件。

当DNA测序与蛋白检测结果不一致时，应该优先检查目标蛋白稳定性、突变类型、等位基因组成、转录本变化及检测方法。

如果这些因素没有得到确认，仅通过提高电脉冲强度或重新更换电转设备，未必能够解决真正的问题。

对于需要开展后续细胞功能研究的项目，建议将DNA编辑、蛋白表达及生物学功能作为相互补充的评价依据。

正在开展原代T细胞、NK细胞或其他哺乳动物细胞的Cas9 RNP基因编辑实验，遇到编辑效率不足、细胞活率下降或者电转结果难以重复的问题？

可以向威尼德提供目标细胞类型、目前使用的电转设备、Cas9 RNP体系、DNA编辑检测结果及具体实验问题，进一步沟通电转设备的脉冲功能、配套耗材和试机适配需求。

威尼德提供Gene Pulser 830方波电穿孔仪等产品，可根据实际细胞电转需求协助评估设备配置及相关技术条件。

技术咨询电话：15532415159

相关设备：Gene Pulser 830方波电穿孔仪

电穿孔仪选型：威尼德电穿孔仪产品中心

在线提交需求：提交细胞类型及电转实验需求

相关技术文章：NK细胞电转总失败？效率低、活率低和功能下降这样排查

技术参考文献

• Biological plasticity rescues target activity in CRISPR knock outs — Nature Methods, 2019

• Highly efficient CRISPR-Cas9-mediated gene knockout in primary human B cells — PLOS Pathogens, 2021

• An optimized workflow for CRISPR-Cas9 deletion of surface and intracellular factors in primary human T lymphocytes — PLOS ONE, 2021

技术说明：本文用于CRISPR RNP基因敲除、蛋白表达检测及电转设备适配的研究参考。不同目标蛋白的降解时间、编辑类型和检测结果可能存在差异，具体实验结论应以经过验证的数据为准。电转设备的脉冲控制功能不等于对特定基因敲除率或蛋白消失时间的保证。