CRISPR RNP电转需要注意什么？9个关键点

CRISPR RNP电转看起来流程并不复杂：准备Cas9蛋白和guide RNA，组装形成RNP复合物，与细胞混合后完成电穿孔，再进行恢复培养和编辑结果检测。

但真正做实验时，很多结果不稳定并不是因为某一个参数完全错误，而是RNP状态、细胞质量、电转体系、脉冲条件以及电转后处理等多个小变量同时发生变化。

尤其对于原代细胞、T细胞、NK细胞、CD34+细胞、iPSC以及其他难转染细胞，单纯增加电脉冲强度并不能保证获得更好的CRISPR编辑结果。

因此，CRISPR RNP电转真正需要控制的是整个实验链条，而不是只盯着电转仪上的几个数字。

一、第一点：先保证Cas9 RNP本身是稳定的

CRISPR RNP电转的第一步，并不是调电压，而是先把Cas9 RNP体系固定下来。

Cas9蛋白需要与guide RNA预先形成RNP复合物。guide RNA既可以采用sgRNA，也可以根据实验体系采用crRNA与tracrRNA组成的双RNA形式。

不同Cas9蛋白和RNA产品的推荐组装条件可能存在差异，因此更稳妥的做法是根据所用试剂的技术资料，先建立固定的RNP组装流程。

参数优化过程中，不建议同时改变Cas9用量、guide RNA用量、组装条件和电脉冲参数。如果多个变量一起改变，即使最终编辑效率提高，也很难知道真正起作用的是哪一项。

二、第二点：不要只看细胞名称，还要看细胞状态

同样叫“T细胞”，并不意味着不同实验批次对电脉冲的耐受程度完全一样。

细胞来源、培养时间、活率、密度、激活状态、扩增阶段以及收集方式等，都可能影响电转后的存活和恢复。

这个问题在原代细胞和免疫细胞中尤其明显。

因此，进行CRISPR RNP电转参数比较以前，最好尽可能统一细胞培养阶段、细胞数量、收集方式和电转前处理过程。

如果需要进一步了解原代和免疫细胞为什么容易出现参数波动，可以查看原代细胞、免疫细胞电转参数优化。

三、第三点：不要把文献参数直接当成自己的标准答案

做CRISPR RNP实验时，根据论文或者厂家Protocol寻找起始参数是合理的，但不能把别人使用的一组电压直接理解成自己的最终条件。

完整的电转条件不仅包括电压，还包括脉冲宽度、脉冲次数、波形、电转体系、样品体积、电极条件以及细胞状态。

不同细胞之间也可能需要完全不同的条件。

例如公开的CRISPR RNP电转Protocol中，A549、iPSC、THP1以及人原代T细胞所采用的电压、脉冲时间和脉冲次数就存在明显差别。

四、第四点：电转体系和样品体积不要随意变化

电转缓冲体系并不是一个可以随意替换的辅助条件。

体系组成、电导率、细胞浓度、样品总体积以及电转杯或电转腔结构，都会共同影响实际放电状态。

如果第一次实验使用一种缓冲体系和样品体积，第二次又换成另一套条件，那么即使仪器上的脉冲参数完全一样，两次实验也已经不是严格意义上的同一个条件。

因此，开始做系统参数优化以后，建议尽可能固定缓冲体系、电转耗材、体系总体积以及细胞数量。

五、第五点：装载样品时注意气泡

气泡是电穿孔实验中非常容易被低估的细节。

如果样品在吸取或装载过程中形成明显气泡，可能影响电极之间的实际导电状态和局部电场分布，严重时还可能增加异常放电风险。

因此，细胞与RNP混合以后应尽量轻柔操作，在装载到电转杯、电转腔或者其他电转耗材时避免产生明显气泡。

六、第六点：参数优化不能只追求最高编辑效率

CRISPR RNP电转的一个常见误区，是把编辑效率最高的一组直接定义为“最佳条件”。

实际上，实验还需要同时观察细胞活率。

随着电脉冲刺激增强，RNP递送可能提高，但细胞受到的压力也可能增加。如果编辑效率从70%提高到80%，同时细胞大量死亡，那么最终真正能够用于后续实验的健康编辑细胞数量未必增加。

因此，对CRISPR RNP电转条件进行判断时，至少应该把编辑效率和细胞活率放在一起看。

七、第七点：电转完成后，恢复培养也要标准化

电脉冲完成以后，实验还没有结束。

细胞需要从电穿孔状态逐渐恢复，并重新进入适合自身生长的培养环境。如果不同实验组从脉冲结束到恢复培养之间等待的时间差异很大，就可能人为增加实验波动。

因此，在开始电转以前最好提前准备好后续培养体系，并尽量统一各实验组的转移和恢复流程。

对于一些对操作较敏感的原代细胞、免疫细胞或者干细胞，这一步尤其不能忽略。

八、第八点：必须区分“RNP递送成功”和“最终编辑成功”

CRISPR RNP电转首先解决的是Cas9 RNP如何进入细胞的问题，但RNP成功进入细胞，并不意味着最终基因编辑结果一定理想。

进入细胞以后，Cas9 RNP还需要识别目标DNA位点、完成切割，并依赖细胞自身的DNA修复过程形成最终编辑结果。

因此，当最终编辑效率偏低时，不能简单把所有问题都归结为电转参数。

guide RNA设计、RNP活性、目标位点、DNA修复过程、检测时间和检测方法，都可能影响最后得到的编辑率。

九、第九点：做好对照和实验记录，才能真正找到问题

如果整个实验只设置一组“RNP + 电转”，一旦失败，很难判断问题到底发生在哪一步。

更加实用的做法，是根据实验目的设置能够回答不同问题的对照组，并把每次实验中的关键变量记录下来。

建议至少记录以下信息：

当这些信息连续记录几轮以后，就能够逐步看出哪些变量与编辑效率、细胞活率或重复性变化有关，而不是每次实验失败都重新猜测。

十、CRISPR RNP电转设备的作用，是帮助建立稳定参数窗口

对于CRISPR RNP实验来说，一台电穿孔仪真正需要解决的并不是“自动给出万能参数”，而是帮助实验人员稳定输出、调整和重复不同电脉冲条件。

Gene Pulser 830方波电穿孔仪主要面向细胞电转实验，可进行方波脉冲条件设置，并支持实际波形显示、预脉冲样品电阻检测、实验方案保存和历史记录查询。

对于需要持续筛选原代细胞、免疫细胞或其他难转染细胞CRISPR RNP条件的实验室，这类功能更适合用于建立自己的参数窗口，而不是依赖一组固定模板。

图4：Gene Pulser 830方波电穿孔仪，可用于CRISPR RNP细胞电转条件筛选

十一、CRISPR RNP电转出现问题时，建议按顺序排查

如果实验出现效率低、死亡率高或者重复性差，不建议一开始就随机更换多个电脉冲参数。

可以按照下面的顺序逐步缩小问题范围：

这样做能够避免一个常见问题：真正发生变化的是细胞或者RNP体系，却不断通过调整电压去“补偿”，最后参数越来越乱，反而更难找到稳定条件。

十二、CRISPR RNP电转真正要追求的是稳定和可重复

CRISPR RNP电转没有一套能够适用于所有细胞的统一条件。

更加可靠的实验策略，是固定RNP制备、细胞状态、电转体系和操作流程，以已有Protocol或文献作为起点，再通过有限范围参数筛选逐渐确定适合自身实验体系的条件。

在这个过程中，不要只记录编辑效率，还应该同时观察细胞活率、恢复情况和后续功能。

当整个实验链条逐渐标准化以后，CRISPR RNP电转才会从“偶尔做成功一次”，变成能够持续复现和进一步优化的实验方法。