Cas9 RNP iPSC电转需要注意什么？

Cas9 RNP用于iPSC基因编辑时，真正需要解决的不只是“怎样把RNP送进细胞”。

iPSC属于人多能干细胞体系，对培养状态、单细胞解离、电转刺激以及电转后的恢复过程都比较敏感。即使基因编辑效率已经达到预期，如果电转后细胞大量死亡、克隆恢复困难，或者细胞状态明显改变，这套参数仍然不能算真正稳定。

因此，Cas9 RNP iPSC电转更适合从完整实验流程进行优化，而不是只寻找一个所谓的“最佳电压”。

一、iPSC电转前，细胞状态比参数本身更重要

如果iPSC在电转以前就已经出现明显分化、克隆边缘异常、细胞密度不合适或者整体活力下降，那么后面的电脉冲优化会非常难解释。

因此，在开始Cas9 RNP参数筛选以前，应先尽量固定细胞培养条件，包括细胞系、传代状态、培养基质、培养阶段、电转前形态以及总体活率。

图1：iPSC实验开始前应先确认细胞培养状态和形态，避免将基础细胞异常误判为电转参数问题

图片来源：Wikimedia Commons，CC BY 4.0

二、单细胞化过程为什么容易影响后面的电转结果？

很多iPSC电转方案需要先把细胞制备成相对均一的单细胞悬液，再与Cas9 RNP体系混合。

问题在于，多能干细胞对单细胞解离本身就比较敏感。如果消化过度、吹打过猛或者解离过程中产生较强机械应力，细胞在进入电穿孔仪以前就可能已经受到损伤。

这样后面即使使用一套原本成熟的电脉冲程序，也可能出现活率下降、贴壁恢复差或者克隆形成效率下降。

三、Cas9 RNP体系要先固定，不要和电转参数一起乱调

Cas9 RNP由Cas9蛋白和guide RNA预先形成复合物，再通过电穿孔递送进入iPSC。

如果同一轮实验中同时改变RNP用量、guide RNA、细胞数量、电压和脉冲宽度，那么最终结果发生变化以后，很难判断真正影响因素。

更适合的做法是先把RNP组装流程固定，再筛选大致电脉冲窗口；电脉冲区域基本稳定以后，再进一步比较RNP剂量或者其他编辑相关变量。

图2：Cas9与guide RNA组成靶向复合体系，RNP进入细胞只是完成基因编辑流程的前半部分

图片来源：Wikimedia Commons，CC BY 4.0

四、iPSC电转参数不能只看一个电压

搜索iPSC CRISPR电转参数时，很容易看到某篇论文中给出的具体电压。但这个数字离开了设备、电转耗材、脉冲时间、次数、体系体积和细胞数量以后，并不能完整复制。

不同实验体系使用的电脉冲条件本身就可能存在差异，因此具体数字更适合作为起始参考，而不是万能答案。

因此，更合理的方法是先找到适合当前iPSC细胞系的大致区域，然后通过小范围梯度逐步缩小参数窗口。

五、iPSC为什么要特别重视电转后的恢复？

电转完成以后，iPSC并不会立即恢复到正常培养状态。

细胞既经历了单细胞解离，又经历了电脉冲刺激，因此电转后早期恢复过程对最终存活和克隆形成非常重要。

不同实验参数组之间，电转结束后的转移时间、恢复培养体系、接种条件以及检测时间应尽量保持一致，否则最终观察到的差异不一定全部来自电脉冲。

六、编辑效率高，但细胞大量死亡，这组参数还算好吗？

不一定。

如果某组iPSC电脉冲能够明显提高RNP递送和编辑效率，但导致大量细胞死亡，后面能够继续用于克隆筛选的有效编辑细胞数量可能反而下降。

七、不要只看活率，还要确认iPSC是否保持需要的状态

对于iPSC实验来说，“细胞还活着”只是最低要求。

完成Cas9 RNP电转以后，还需要根据项目目的确认细胞是否维持需要的多能干细胞状态，尤其是在后续需要建立克隆细胞系、开展疾病模型研究或者进一步诱导分化时。

因此，一套稳定的iPSC编辑流程通常需要把编辑效率、细胞生长状态以及多能性相关表型分开评价。

图3：RNP成功递送后仍需要经过DNA靶向、切割和修复，因此递送成功不等于最终编辑结果一定理想

图片来源：Wikimedia Commons，CC BY-SA

八、如果需要建立单克隆细胞系，还要多考虑一步

很多iPSC基因编辑项目最终不是获得一个混合编辑细胞群，而是需要进一步筛选单克隆。

这时前面的一切条件都会影响后续效率：电转后剩余多少健康细胞、单细胞恢复能力如何、目标编辑比例多高，都会影响最终需要筛选多少克隆。

因此，如果最终实验目标就是建立编辑后的iPSC克隆，那么参数优化就应该从一开始把“克隆恢复能力”考虑进去，而不是只看早期编辑数字。

九、气泡和装载操作为什么仍然不能忽略？

把iPSC与Cas9 RNP混合后装入电转耗材时，应尽量避免出现明显气泡。

气泡可能干扰正常的电场和放电过程，而iPSC本身又已经经历单细胞解离，因此异常放电带来的额外损伤更加不利于后续恢复。

十、不同iPSC细胞系为什么不能机械照搬参数？

不同iPSC细胞系对于单细胞解离、培养以及电转刺激的耐受程度可能不同。

一套参数在某个细胞系上能够获得理想结果，并不代表更换另一个iPSC细胞系以后能够完全复制。

所以更加实用的方法，是建立一个经过重复验证的参数窗口，而不是只保存一个所谓的“标准电压”。

十一、iPSC Cas9 RNP电转失败，可以怎么排查？

十二、Cas9 RNP iPSC电转对设备有什么要求？

iPSC参数开发需要的是能够稳定设置、比较和重复不同方波条件，而不是设备自动提供一组所谓的“iPSC万能参数”。

Gene Pulser 830方波电穿孔仪主要面向哺乳动物细胞、原代细胞和干细胞等真核细胞电转，可设置脉冲时间、间隔和个数，并显示实际电压、脉冲时间、间隔、个数及波形。

设备还支持预脉冲样品电阻测量、电弧保护、实验方案保存和历史记录查询。对于需要不断比较编辑效率与iPSC恢复状态的实验，这些功能可以帮助实验人员把成功和失败条件完整保存下来，再逐步建立稳定的参数窗口。

图4：Gene Pulser 830方波电穿孔仪，可用于Cas9 RNP iPSC参数窗口筛选与实验复现

十三、Cas9 RNP iPSC优化真正要建立的是完整SOP

Cas9 RNP iPSC电转不存在一个能够覆盖所有细胞系的固定数字。

更加稳定的方法，是从细胞状态开始，把单细胞解离、RNP组装、细胞数量、电转体系、电脉冲条件和恢复培养逐步标准化。

参数筛选时同时记录编辑效率、细胞活率、恢复情况和未分化状态；如果项目最终需要建立单克隆，则继续把克隆形成和后续验证纳入评价。

当这些变量逐渐固定以后，实验室得到的就不是一次偶然成功的iPSC编辑实验，而是一套能够在不同批次中持续验证和调整的Cas9 RNP电转流程。