Cas9 RNP CD34+细胞电转怎么做？优化要点

Cas9 RNP用于CD34+造血干/祖细胞（HSPC）基因编辑时，真正需要解决的并不只是“RNP能不能送进去”。

CD34+细胞属于珍贵的原代细胞体系，细胞来源、解冻或分离后的状态、电转前培养、Cas9 RNP体系、电脉冲条件以及电转后的恢复过程，都可能影响最终结果。

而且评价一套CD34+细胞电转条件时，不能只看基因编辑效率。细胞活率、CD34表型保持情况、恢复扩增能力以及后续祖细胞功能，同样需要纳入判断。

一、先明确CD34+细胞到底来自哪里

进行Cas9 RNP电转以前，首先需要明确CD34+细胞的来源。

研究中常见的CD34+ HSPC可以来源于脐带血、骨髓或者动员外周血等不同样本。即使都表达CD34，不同来源、不同供体以及新鲜或冻存样品之间，也可能存在状态差异。

因此，一套在某一种来源CD34+细胞上建立的参数，可以作为其他样品的参考起点，但不适合直接理解成所有CD34+细胞的统一程序。

如果需要先了解原代细胞为什么不能直接照搬普通细胞系参数，可以查看原代细胞、免疫细胞电转参数优化。

二、电转前培养状态为什么很重要？

CD34+ HSPC在正式进行RNP递送以前，通常需要先进入相对稳定的培养状态。

公开的CD34+ HSPC CRISPR流程也会把细胞分离或解冻后的预培养作为独立步骤，再进行RNP组装和递送。这说明细胞培养状态本身就是完整实验方案的一部分，而不是与电转参数无关的准备工作。

因此，在进行参数比较时，应尽可能统一不同实验组的培养时间、培养体系、细胞密度以及电转前处理过程。

如果一批细胞刚刚解冻，另一批已经恢复培养较长时间，却直接比较相同电脉冲后的活率，结果很容易受到细胞初始状态干扰。

三、Cas9 RNP体系要先稳定，再比较电脉冲

Cas9 RNP由Cas9蛋白与guide RNA预先形成复合物，再通过电穿孔递送进入CD34+细胞。

在参数优化阶段，如果Cas9用量、guide RNA、RNP组装条件和电脉冲条件同时不断变化，那么最后即使编辑效率发生变化，也很难判断究竟是哪一个变量造成。

因此更适合采用分阶段优化方式：

四、CD34+细胞电转参数不能只记录一个电压

从公开Protocol寻找CD34+ HSPC的参考条件是合理的，但不能只抄下其中一个电压数字。

完整的电转条件还包括脉冲持续时间、脉冲次数、波形、样品体积、电极条件、缓冲体系以及每次处理的细胞数量。

只要其中某一项发生变化，相同的设置电压也不一定产生完全相同的实际效果。

五、参数筛选时要同时看编辑效率和细胞活率

CD34+细胞属于珍贵原代样品，所以不适合只追求最高编辑率。

如果某组电脉冲能够进一步提高编辑率，却导致大量细胞损失，那么最终真正获得的有效编辑细胞数量未必增加。

六、CD34表达保持情况为什么值得单独观察？

CD34+ HSPC实验与普通细胞系的一个重要区别，是研究者往往不仅关心目标基因有没有编辑，还关心编辑以后细胞是否仍然保持需要的造血干/祖细胞特征。

因此，如果一组条件能够获得较高编辑率，但细胞状态明显下降或者CD34相关表型发生不希望出现的变化，就需要进一步判断这是不是由电转刺激、RNP体系或者培养过程造成。

已有研究也观察到，某些RNP相关条件可能伴随CD34表达下降、细胞数量减少以及集落形成能力下降。这说明CD34+细胞编辑不能只用一个编辑百分比评价。

七、电转后恢复培养也是完整参数的一部分

电脉冲结束以后，CD34+细胞需要重新进入合适的培养环境。

公开HSPC RNP电转流程通常会提前准备电转后的培养体系，并在电转结束以后及时转移细胞进行恢复。这说明恢复培养不应该被理解成“电转完成后的普通操作”，而应该作为整个SOP的一部分固定下来。

进行不同参数组比较时，建议尽可能保持以下条件一致：

八、为什么样品中的气泡要特别注意？

CD34+细胞样品数量通常比较珍贵，因此更应该避免因为操作细节造成异常放电。

在RNP与细胞混合以及装载进入电转耗材过程中，应尽量避免形成明显气泡。

公开CD34+ HSPC电转Protocol也特别指出，电转样品中出现气泡可能明显降低细胞活率和转染效率。

九、除了活率和编辑率，还应该看祖细胞功能

如果研究目标涉及造血干/祖细胞长期应用，仅仅证明细胞还“活着”并不等于这套条件就是理想条件。

编辑以后的CD34+细胞还可以根据研究目的继续评价集落形成能力、分化能力以及其他能够反映祖细胞功能的指标。

公开的CD34+ HSPC CRISPR流程也建议通过CFU等实验评估修改后的祖细胞功能，并可进一步进行不同造血谱系的分化研究。

十、不同供体之间应该怎样建立参数窗口？

原代CD34+细胞的供体差异无法完全消除，因此不建议期待找到一组以后永远不变的固定参数。

更加实用的做法，是通过多个批次实验逐渐形成一个工作窗口。

十一、Cas9 RNP CD34+细胞电转失败，建议怎么排查？

十二、CD34+细胞Cas9 RNP电转对设备有什么要求？

对于CD34+ HSPC这类珍贵原代细胞，设备最重要的价值不是提供一个所谓的“万能CD34参数”，而是能够帮助实验人员稳定建立、调整和重复不同方波条件。

Gene Pulser 830方波电穿孔仪面向原代细胞、干细胞等真核细胞转染应用，可独立控制方波脉冲相关条件，并显示实际电压、脉冲时间、间隔、个数及波形。

设备同时提供预脉冲样品电阻测量、电弧保护、实验方案保存和历史记录查询。对于CD34+细胞实验，这些功能更适合用来比较不同条件、发现明显异常样品，并把经过验证的程序保存下来重复使用。

图6：Gene Pulser 830方波电穿孔仪，可用于Cas9 RNP CD34+细胞参数窗口筛选和实验复现

十三、CD34+细胞Cas9 RNP优化，最终不是追求一个数字

Cas9 RNP CD34+细胞电转真正需要建立的是一套完整、可重复的实验窗口。

先固定细胞来源和培养状态，再固定RNP制备、细胞数量、缓冲体系和样品条件，然后以已有Protocol或实验数据为起点进行小范围电脉冲筛选。

每一轮实验不仅记录编辑效率，还要同时观察细胞活率、CD34表型、恢复情况，以及在项目需要时进一步验证祖细胞相关功能。

这样经过多个供体和批次积累以后，实验室得到的不再只是“某次实验用过多少伏”，而是一套能够根据CD34+细胞实际状态进行调整的Cas9 RNP电转方法。