巨噬细胞电转怎么做？参数优化与细胞活率验证

巨噬细胞电转是免疫学、细胞生物学、炎症信号通路及基因功能研究中常用的外源分子递送方法。对于需要将质粒DNA、siRNA、mRNA或CRISPR相关材料导入巨噬细胞的实验室而言，电穿孔是一种具有公开研究依据的非病毒递送方式。

但巨噬细胞不同于常规HEK293等细胞系。它们参与先天免疫识别、吞噬及炎症调节，对外源核酸和实验处理可能产生复杂的生物学反应。

实际研究中，科研人员经常遇到以下问题：RAW264.7与THP-1诱导巨噬细胞能否使用相同电转参数？原代巨噬细胞为什么容易出现转染效率低或细胞死亡？为什么已经检测到较高的siRNA荧光阳性率，却没有观察到预期的基因敲低？为什么电转后细胞存活正常，但炎症因子表达发生变化？

这些问题不能只通过调整电压解决。巨噬细胞电转还需要考虑细胞来源、分化状态、导入材料、细胞免疫激活及后续功能验证。

本文结合RAW264.7、THP-1及小鼠骨髓来源巨噬细胞的公开研究，介绍巨噬细胞电转原理、参考参数、递送效率、细胞活率与功能评价方法，并提供电穿孔仪选型参考。

一、巨噬细胞电转是什么？

巨噬细胞（Macrophage）是先天免疫系统的重要组成部分，参与吞噬、细胞碎片清除、免疫信号传递和组织稳态维持等生物学过程。

巨噬细胞电转是指利用电脉冲暂时改变细胞膜通透性，使外源核酸或其他适当分子进入细胞，随后观察其表达、基因调控或相关功能。

在科研实验中，巨噬细胞电转通常涉及以下研究方向：

• 利用siRNA研究目标基因敲低；

• 通过质粒DNA开展报告基因表达；

• 研究炎症相关信号通路及基因调控；

• 递送mRNA等材料进行瞬时表达研究；

• 在有可靠依据的条件下开展CRISPR相关基因编辑研究；

• 分析外源分子递送后巨噬细胞的吞噬、炎症和其他功能变化。

需要注意，电转仪完成放电，并不代表目标核酸已经成功发挥作用。实际实验还需要根据研究目的验证报告基因表达、基因敲低或其他功能结果。

二、RAW264.7、THP-1和原代巨噬细胞有什么区别？

巨噬细胞电转研究中，经常出现RAW264.7、THP-1和BMDM等名称。

这些细胞并不是同一种实验对象，不能因为都用于巨噬细胞研究，就直接使用相同的电转条件。

1. RAW264.7细胞

RAW264.7是小鼠来源的巨噬细胞样细胞系，广泛应用于免疫信号、炎症反应及细胞功能研究。

由于它属于长期培养的细胞系，其遗传背景、增殖特性和实验响应不一定代表小鼠原代巨噬细胞。

2. THP-1诱导巨噬细胞

THP-1是人单核细胞白血病来源的细胞系。研究人员通常采用特定诱导条件，使THP-1细胞获得部分巨噬细胞样特征。

THP-1未诱导细胞、诱导过程中的细胞以及完成诱导的巨噬细胞样细胞，可能具有不同的培养状态和电转耐受性。

因此，不能将THP-1单核细胞电转参数直接视为THP-1诱导巨噬细胞的通用方案。

3. BMDM骨髓来源巨噬细胞

BMDM（Bone Marrow-Derived Macrophages）通常指由骨髓来源细胞在适当条件下分化获得的巨噬细胞。

这类细胞常用于小鼠原代巨噬细胞研究。

与RAW264.7细胞系相比，BMDM通常更需要关注动物来源、细胞分化条件、批次差异及后续功能。

4. 人单核细胞来源巨噬细胞

人单核细胞来源巨噬细胞通常由外周血单核细胞经过体外培养分化获得。

对于这类实验，还需要考虑不同供体的差异，以及培养和分化条件对细胞状态的影响。

结论：巨噬细胞电转参数应落实到具体细胞模型。不能把RAW264.7、THP-1和原代BMDM当成具有相同转染特性的细胞。

三、为什么巨噬细胞比较难转染？

巨噬细胞转染困难，可能涉及外源分子递送、细胞内识别、细胞损伤和功能变化等多个因素。

1. 对外源核酸的免疫识别

巨噬细胞具有识别外源核酸及其他分子信号的能力。

如果某些DNA或RNA进入细胞内特定位置，可能激活相应的先天免疫反应，并影响细胞存活或炎症信号。

因此，外源核酸不是对所有巨噬细胞都完全没有影响的实验材料。

2. 原代细胞对DNA递送可能更加敏感

1993年发表于《Immunology and Cell Biology》的研究《Electroporation and DNA-dependent cell death in murine macrophages》，比较了RAW264细胞与小鼠骨髓来源巨噬细胞的电穿孔结果。

研究发现，在其测试条件下，RAW264细胞可以通过电穿孔实现DNA递送，而部分骨髓来源原代巨噬细胞在导入DNA后出现明显死亡。

值得注意的是，研究中的无DNA电穿孔对照并没有出现相同程度的毒性，提示细胞损伤可能与导入的DNA本身有关。

这一研究说明，巨噬细胞电转后大量死亡，不一定全部来自电脉冲，也可能涉及外源DNA引起的细胞反应。

该结论来自特定的早期研究条件，并不表示所有原代巨噬细胞都不能进行质粒DNA电转。后续研究已发展出适用于部分原代巨噬细胞的其他递送体系。

3. 细胞收集和脱附造成的应激

部分巨噬细胞以贴壁状态培养。采用传统电转杯或部分悬液式电转系统时，需要先将细胞转移到合适的悬液中。

细胞脱附、收集和重新接种可能影响细胞活率及后续功能。

因此，转染结果不佳时，应同时检查操作过程，而不是只检查电脉冲参数。

4. 递送阳性不代表功能性转染成功

巨噬细胞具有摄取和吞噬外源材料的能力。部分检测到的荧光信号可能来自细胞表面吸附或胞内囊泡中的材料。

因此，需要区分检测到外源材料信号与材料真正到达合适的作用位置。

例如，siRNA要产生目标基因敲低作用，需要能够参与细胞内RNA干扰过程。

质粒DNA还需要完成适当的细胞内转运和表达，才能检测到对应报告基因结果。

四、巨噬细胞电穿孔与脂质体转染有什么区别？

常见的非病毒递送方法包括脂质体等化学转染方式，以及电穿孔等物理递送方式。

电穿孔通过外加电脉冲改变细胞膜通透性，为外源分子进入细胞创造条件。

对于某些巨噬细胞模型，脂质体转染经过适当优化后，也可以实现有效递送。

因此，不能认为巨噬细胞必须使用电穿孔，也不能保证电穿孔在所有实验中都优于化学转染。

如果实验室现有化学转染方案已经能够获得可靠的基因敲低、细胞存活和功能结果，则不必仅因为细胞属于巨噬细胞就直接更换设备。

五、公开研究中的巨噬细胞电转效率是多少？

不同研究采用的巨噬细胞模型、递送材料和电转平台并不相同，因此需要分别看待实验数据。

1. 2014年：THP-1诱导巨噬细胞电转

2014年发表于《Journal of Visualized Experiments》的研究《Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection》，介绍了通过Nucleofector系统向THP-1诱导巨噬细胞递送siRNA及质粒DNA的实验方法。

研究人员先使THP-1细胞进入相应的巨噬细胞样分化阶段，再采用适当的细胞脱附方式进行电转。

论文报告，在其特定实验条件下，荧光标记siRNA的递送阳性比例通常超过90%。

研究同时检测了细胞凋亡与坏死情况：

这些数值属于该论文所报告的特定检测结果。虽然研究认为其方法能够较好地保留细胞活力，但电转组的凋亡与坏死比例并不是完全没有变化。

另外，超过90%指的是荧光标记siRNA的递送阳性比例，不能直接写成目标基因敲低效率超过90%。

2. 2014年：RAW264.7及J774A.1细胞电转研究

2014年发表于《Journal of Visualized Experiments》的另一项研究《Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages》，介绍了利用Amaxa Nucleofector 96孔系统，向RAW264.7和J774A.1等小鼠巨噬细胞样细胞系递送siRNA的研究方法。

论文报告，在相应研究体系中，GFP表达质粒的转染阳性率约为30%—50%，而荧光标记siRNA的检测阳性率超过99%。

这组数据说明，即使使用相同类型的巨噬细胞电转平台，DNA质粒表达与荧光siRNA递送也可能呈现明显不同的结果。

研究人员还指出，针对不同靶基因的siRNA敲低效果可能存在差异，需要通过对应的基因表达及功能检测进一步确认。

3. 2010年：小鼠骨髓来源原代巨噬细胞

2010年发表于《Journal of Immunological Methods》的研究《Small interfering RNA (siRNA) delivery into murine bone marrow-derived macrophages by electroporation》，针对小鼠骨髓来源巨噬细胞建立了siRNA电转方法。

研究报告，在所使用的特定体系中，荧光标记siRNA的电转阳性比例通常超过95%。

该研究进一步使用针对MAPK1和CD86等靶点的siRNA，检测到相应的目标蛋白表达降低。

同时，研究人员还评价了细胞存活、吞噬和降解能力，以及对炎症刺激的反应。

在研究所测试的条件下，电转过程没有明显破坏上述部分巨噬细胞功能。

这项结果说明，部分原代巨噬细胞可以通过经过验证的电穿孔体系实现有效siRNA递送，但不能据此认为全部原代巨噬细胞都适用相同参数。

4. 2020年：RAW264.7质粒设计对转染结果的影响

2020年发表于《BMB Reports》的研究《Antibody-secreting macrophages generated using CpG-free plasmid eliminate tumor cells through antibody-dependent cellular phagocytosis》，采用微电穿孔相关技术研究不同质粒在RAW264.7巨噬细胞中的递送及表达。

在论文比较的几种GFP表达质粒中，研究报告了以下结果：

这些差异来自论文中的不同质粒设计及具体实验体系。

研究结果提醒实验人员：即使目标细胞和电转平台相同，质粒大小、序列构成及其他载体特征，也可能明显影响表达和细胞存活。

因此，如果RAW264.7质粒电转出现效率低或死亡较多，应同时检查质粒设计和材料本身，而不是只考虑提高电压。

六、巨噬细胞电转参数应该如何选择？

不同巨噬细胞具有不同的电转耐受性和递送要求，不能使用统一的电压作为所有模型的标准条件。

以下参数仅用于说明公开研究中已经使用过的具体实验体系。

小鼠BMDM的指数衰减波参考条件

Wiese等在2010年小鼠骨髓来源巨噬细胞siRNA电转研究中，报告了以下条件：

该实验体系采用的电转杯电极间距为4 mm。上述电压、电阻、电容与样品条件必须作为整体理解。

重要说明：这些参数只属于Wiese等研究中相应设备和小鼠BMDM实验体系的参考值，不属于威尼德Gene Pulser 830或Gene Pulser X2的推荐程序。

其他巨噬细胞、不同电转杯及不同缓冲体系，不能直接套用400 V、150 μF和100 Ω。

不同设备为什么不能只复制电压？

对于传统电转杯，名义电场强度可表示为：

E＝V÷d

其中V为施加电压，d为电极间距。

同样的电压，如果对应不同电极间距，名义电场强度就可能不同。

此外，不同设备的波形、脉冲时间和电路结构也可能不同。

因此，Lonza Nucleofector、Neon及传统电转杯设备的程序不能直接以电压数字互相转换。

七、影响巨噬细胞电转效率的主要因素有哪些？

1. 不要忽略细胞激活状态

巨噬细胞研究经常需要评价炎症或免疫调节相关功能。

但细胞在电转前的分化与激活状态，可能影响后续实验结果。

因此，参数比较时，应尽量确保细胞来源、培养条件及起始状态具有可比性。

2. 核对DNA和RNA材料

质粒DNA、siRNA和mRNA具有不同的作用机制。

对于巨噬细胞，外源核酸本身还可能影响免疫信号，因此应同时考虑材料纯度、潜在内毒素污染及相应实验对照。

不能把普通质粒DNA电转条件直接等同于siRNA或mRNA递送条件。

3. 合理控制电转后恢复

部分巨噬细胞电转前需要脱附，电转后还需要恢复贴壁和正常培养状态。

如果只在放电后短时间内测量活率，而不观察后续细胞恢复，就可能遗漏部分实验问题。

八、巨噬细胞电转后为什么必须检测免疫激活？

对于巨噬细胞来说，维持正常的研究功能与实现递送同样重要。

如果实验目的是研究炎症信号通路，电转处理本身或导入的核酸材料可能影响相关指标。

例如，根据具体实验设计，研究人员可能关注：

• TNF-α、IL-6等炎症相关因子的表达；

• CD80、CD86或其他与细胞状态相关的表面标志物；

• 目标基因的mRNA和蛋白表达；

• 细胞吞噬能力及相关功能；

• 细胞存活、恢复及增殖状态。

这些指标并非所有巨噬细胞电转实验都必须完整检测，应根据目标研究问题合理选择。

此外，不能仅凭某一个表面标志物，就认定巨噬细胞必然处于某种完整的极化状态。

如果电转组出现炎症因子变化，需要通过无载荷电转、非靶向核酸及其他适当对照，区分电脉冲、递送材料和目标基因的作用。

九、巨噬细胞电转成功以后，如何验证实验结果？

1. 报告基因表达检测

对于GFP等报告基因质粒，可通过流式细胞术或荧光显微镜，检测相应蛋白表达。

应明确检测对象是全部细胞还是存活细胞，并排除异常荧光背景。

2. siRNA递送检测

荧光标记siRNA可以辅助判断外源材料的递送信号。

但是，荧光阳性比例不能直接等同于目标基因敲低效率。

尤其对于具有摄取能力的巨噬细胞，应注意区分胞内功能性递送、细胞表面残留和其他非功能性信号。

3. mRNA敲低检测

如果实验目标是siRNA介导的基因敲低，可通过适当的RT-qPCR分析目标mRNA表达变化。

检测时应使用经过验证的内参及合适的阴性对照。

4. 蛋白表达检测

根据目标蛋白的性质，可以使用Western blot、流式细胞术或其他适当方法进行验证。

部分目标蛋白具有较长的半衰期，mRNA已经下降时，蛋白表达可能仍然存在。

5. 细胞存活及回收

建议记录电转前后的细胞状态、细胞活率及最终回收细胞数量。

对于原代巨噬细胞，能够获得足够数量、具有研究所需功能的存活细胞，通常比单纯的高荧光阳性率更加重要。

6. 吞噬与免疫功能

如果研究目标涉及巨噬细胞的吞噬、炎症或免疫调节能力，还应根据实验目的评价对应功能。

例如，Wiese等2010年研究不仅检测了siRNA递送，还对巨噬细胞的吞噬、降解能力和炎症响应进行了评价。

这种验证思路能够帮助研究人员判断电转处理是否影响细胞原有功能。

十、巨噬细胞电转需要设置哪些对照组？

如果实验涉及炎症刺激、吞噬功能或免疫表型，还应根据研究目的设计相应的功能对照。

需要注意，不同实验组应尽量保持细胞来源、培养时间和检测方法一致。

十一、巨噬细胞电转效率低或细胞死亡多，如何排查？

如果无载荷电转对照存活正常，而加入质粒DNA后细胞死亡明显增加，应优先考虑DNA材料和相关细胞反应。

如果无载荷电转对照本身就出现明显损伤，则需要进一步检查细胞状态、脉冲条件、缓冲液及操作过程。

如果细胞活率正常，但目标基因敲低不明显，应先核实核酸序列、材料质量和实际检测结果，避免直接增加电压。

十二、巨噬细胞电转实验如何选择电穿孔仪？

对于计划开展巨噬细胞核酸递送研究的实验室，应重点关注设备的脉冲波形、参数控制、实际输出监测及耗材适配能力。

但设备具备细胞转染功能，并不代表已经针对RAW264.7、THP-1或原代巨噬细胞完成独立的转染效率验证。

1. Gene Pulser 830方波电穿孔仪

威尼德Gene Pulser 830采用方波输出，主要面向哺乳动物细胞、悬浮细胞、原代细胞及其他真核细胞转染研究。

根据威尼德官方资料，该设备支持分别设置脉冲强度、时间、间隔和次数，并具备实际波形显示、预脉冲电阻测量、实验方案保存及历史记录查询等功能。

设备可保存600条实验方案，并支持查询100条历史记录，便于多项目实验室管理已有参数和查看实际放电情况。

对于需要开展方波参数比较、细胞活率评价及核酸递送研究的实验室，可以结合具体巨噬细胞模型和设备规格，评估其是否满足实验需要。

需要注意，威尼德官网提供了CHO-K1和HepG2等细胞的特定转染实验数据，但这些数据不能当成RAW264.7、THP-1或原代巨噬细胞的实测结果。

产品详情：Gene Pulser 830方波电穿孔仪。

2. Gene Pulser X2双波电穿孔仪

Gene Pulser X2集成方波与指数衰减波两种输出方式，可供同时开展哺乳动物细胞递送及微生物电转化的实验室进行选型。

根据威尼德官网资料，该设备具有10英寸触摸屏、实际波形监测、预脉冲电阻检测、极性转换及电弧保护等功能。

如果实验室既开展巨噬细胞核酸递送研究，也开展细菌、酵母等其他实验，可以结合不同项目的波形需求，评估双波系统。

官网提供了多种常见细胞和微生物的参考预设程序，但没有将RAW264.7、THP-1或BMDM列为已完成独立效率验证的预设实验数据。

因此，不能因为设备具有24种预设程序，就认为其已经验证适用于所有巨噬细胞。

产品详情：Gene Pulser X2双波电穿孔仪。

3. 830与X2应该怎样选择？

产品适用性说明：威尼德830和X2的官方资料能够证明其对应的波形及参数功能，但本文未引用两款设备在RAW264.7、THP-1或原代巨噬细胞中的独立转染效率、细胞活率及免疫功能实测数据。

本文不会将其他品牌研究中的超过90%或95%的荧光siRNA递送阳性比例，作为威尼德电穿孔仪的产品性能声明。

十三、巨噬细胞电转常见问题

1. 巨噬细胞可以使用电穿孔仪进行转染吗？

可以。已有公开研究在RAW264.7、THP-1诱导巨噬细胞及原代骨髓来源巨噬细胞中开展电穿孔递送。但不同细胞和材料需要分别验证。

2. RAW264.7巨噬细胞电转需要多少伏？

没有统一推荐电压。RAW264.7的实际条件取决于设备平台、波形、电转耗材、缓冲体系和递送材料，应优先参考可比的实验协议。

3. THP-1与RAW264.7可以使用同样的电转参数吗？

不建议直接套用。两者分别具有不同的人或小鼠来源及细胞背景。THP-1是否已经诱导为巨噬细胞样状态，也会影响实验条件。

4. 巨噬细胞电转一定需要使用方波吗？

不一定。公开研究中既有采用方波的巨噬细胞递送体系，也有采用指数衰减波的研究。选择应以具体细胞及设备资料为依据。

5. 原代巨噬细胞电转死亡率高，是不是电压过高？

可能涉及电脉冲，但也可能与DNA敏感性、材料纯度、细胞收集及恢复培养有关。应结合无载荷电转对照和其他实验组区分原因。

6. siRNA荧光阳性超过95%，是不是基因敲低效率也超过95%？

不是。荧光阳性反映相应递送信号，实际基因敲低还需要通过mRNA、蛋白或相关功能检测确认。

7. 巨噬细胞电转后需要检查炎症因子吗？

如果研究目标涉及炎症、免疫激活或相关信号通路，建议根据实验设计设置相应检测和对照。如果研究目标不同，则应选择真正相关的功能指标。

8. 电转以后巨噬细胞还能保持吞噬能力吗？

部分公开研究在特定条件下保留了巨噬细胞的吞噬和其他免疫功能，但不能保证全部细胞及电转体系都具有相同表现。

9. BMDM电转参数可以直接用于人原代巨噬细胞吗？

不能直接套用。小鼠骨髓来源巨噬细胞与人单核细胞来源巨噬细胞的来源及培养条件不同，应独立验证。

10. 电转仪支持原代细胞，就代表适合所有巨噬细胞吗？

不代表。设备具备相应电学功能，只是建立实验体系的条件之一。仍需要核实具体细胞、递送材料、耗材及结果验证。

十四、巨噬细胞电转设备与技术咨询

对于正在开展RAW264.7、THP-1、BMDM或人原代巨噬细胞研究的实验室，设备选型应从具体实验问题出发。

如果已经出现电转阳性率低、细胞死亡较多、基因敲低不明显或炎症信号异常等情况，建议在设备咨询时提供以下信息：

• 巨噬细胞类型、物种及来源；

• 是否为RAW264.7、THP-1或原代BMDM等模型；

• THP-1等细胞是否已经完成相应诱导；

• 实际导入质粒DNA、siRNA、mRNA还是其他材料；

• 当前使用的设备、波形、电转杯及缓冲液；

• 已有完整脉冲参数及实际输出记录；

• 电转前后细胞活率和回收数量；

• 荧光表达、基因敲低或目标功能检测结果；

• 是否出现细胞死亡、吞噬功能变化或异常免疫激活。

威尼德生物科技（北京）有限公司提供方波及双波电穿孔仪，可围绕实际细胞模型、研究任务、设备波形、参数控制及耗材适配进行技术沟通。

方波设备：Gene Pulser 830方波电穿孔仪

双波设备：Gene Pulser X2双波电穿孔仪

在线咨询：提交巨噬细胞电转与设备选型咨询需求

联系电话：15532415159

十五、参考文献与图片来源

1. Maeß MB, Wittig B, Lorkowski S. Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection. Journal of Visualized Experiments, 2014.查看THP-1巨噬细胞电转研究。

2. Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages. Journal of Visualized Experiments, 2014.查看RAW264.7与J774A.1电转研究。

3. Wiese M, Castiglione K, Hensel M, et al. Small interfering RNA (siRNA) delivery into murine bone marrow-derived macrophages by electroporation. Journal of Immunological Methods, 2010.查看BMDM原代巨噬细胞电转研究。

4. Stacey KJ, Ross IL, Hume DA. Electroporation and DNA-dependent cell death in murine macrophages. Immunology and Cell Biology, 1993.查看巨噬细胞DNA递送与细胞死亡研究。

5. Cha EB, Shin KK, Seo J, Oh DB. Antibody-secreting macrophages generated using CpG-free plasmid eliminate tumor cells through antibody-dependent cellular phagocytosis. BMB Reports, 2020.查看RAW264.7不同质粒表达和细胞活率研究。

6. Moradian H, et al. mRNA Transfection-Induced Activation of Primary Human Monocytes and Macrophages: Dependence on Carrier System and Nucleotide Modification. Scientific Reports, 2020.查看外源mRNA递送与巨噬细胞免疫激活研究。该研究主要评估化学递送体系，不能作为电转效率数据使用。

7. 威尼德生物：Gene Pulser 830方波电穿孔仪技术资料。

8. 威尼德生物：Gene Pulser X2双波电穿孔仪技术资料。

9. 图1：NIAID，Macrophage by NIAID，Wikimedia Commons。查看原图；CC BY 2.0授权。图片未修改。

10. 图2：Richard Wheeler（Zephyris），Electroporation Diagram，Wikimedia Commons。查看原图；CC BY-SA 3.0授权。图片未修改。

11. 图3、图4：威尼德生物官方网站Gene Pulser 830及Gene Pulser X2产品实物图。

技术说明：本文介绍巨噬细胞电穿孔的研究原理、参考参数、细胞活率及结果验证。RAW264.7、THP-1与原代巨噬细胞具有不同实验特性。文中第三方研究参数和递送效率不属于威尼德设备独立实测结果，也不能直接作为其他电转仪的通用设置。具体实验应根据细胞来源、递送材料、设备规格及可靠研究资料进行验证。本文仅用于科研技术交流。