原代成纤维细胞电转怎么做？参数与细胞活率优化

原代成纤维细胞电转是细胞生物学、组织修复、纤维化、细胞衰老及基因功能研究中常用的外源分子递送方法。对于需要将质粒DNA、siRNA、mRNA或基因编辑相关材料导入原代成纤维细胞的实验室而言，选择适当的电穿孔条件，有助于在递送效果和细胞存活之间取得平衡。

实际实验中，研究人员经常遇到以下问题：原代成纤维细胞电转一般需要多少伏？人皮肤成纤维细胞与牛胎儿成纤维细胞能否使用相同参数？为什么荧光标记siRNA的阳性率较高，质粒转染效率却明显较低？为什么电脉冲后细胞能够存活，却迟迟不能恢复正常贴壁和增殖？

这些问题不能仅通过改变电压解决。原代成纤维细胞的来源、供体差异、传代次数、细胞状态、递送材料及电转缓冲体系，都可能影响最终实验结果。

本文结合2008年人原代成纤维细胞电转研究和2020年牛胎儿原代成纤维细胞方波研究，介绍公开参考参数、实验影响因素、递送效率与细胞活率评价，以及电穿孔仪设备选型方法。

一、什么是原代成纤维细胞？

成纤维细胞（Fibroblast）是多种结缔组织中的重要细胞，参与细胞外基质合成、组织稳态维持、损伤修复及纤维化等生物学过程。

原代成纤维细胞通常来源于组织直接分离建立的细胞培养体系，与经过长期培养或永生化处理的细胞系不同。

常见研究对象包括：

• 人原代皮肤成纤维细胞：常用于皮肤修复、细胞外基质、衰老和纤维化研究。

• 人原代肺成纤维细胞：常用于肺组织修复、基质重塑及肺纤维化相关研究。

• 心脏来源成纤维细胞：常用于心脏组织重塑及纤维化相关研究。

• 牛胎儿原代成纤维细胞：可用于家畜遗传改造和相关细胞工程研究。

不同组织来源的成纤维细胞可能具有不同的转录特征、分化状态和实验响应，因此不能将某一组织或物种的电转结果直接推广至全部原代成纤维细胞。

二、原代成纤维细胞与NIH/3T3细胞有什么区别？

在搜索成纤维细胞转染参数时，经常可以找到NIH/3T3等细胞系的实验资料。

但NIH/3T3属于小鼠成纤维细胞系，而人原代皮肤成纤维细胞、牛胎儿原代成纤维细胞属于不同的实验对象。

因此，NIH/3T3细胞的电转电压和转染效率，不能直接作为人原代成纤维细胞的推荐参数。

即使都是人原代皮肤成纤维细胞，供体来源和传代状态也可能造成实验结果差异。

三、原代成纤维细胞为什么需要考虑电穿孔？

原代成纤维细胞可以通过多种方法递送外源分子，包括部分化学转染方法及电穿孔等物理递送方式。

对于已经能够利用现有化学转染方法获得可靠结果的实验室，并不一定需要更换电转设备。

但是，如果实验对象对某种转染试剂响应不足，或者需要直接递送特定核酸及蛋白复合物，可以进一步评估电穿孔技术。

电穿孔通过外加电脉冲改变细胞膜通透性，使外源分子有机会进入细胞。

对于原代成纤维细胞，电转后的细胞恢复能力尤其重要。即使获得了较高的递送阳性率，如果大量细胞无法继续贴壁、增殖或完成后续实验，该条件仍可能不适合实际研究。

四、人原代成纤维细胞有哪些公开电转参数？

2008年，Jordan等人在《Journal of Biomolecular Techniques》发表研究《Optimizing Electroporation Conditions in Primary and Other Difficult-to-Transfect Cells》。

该研究使用Bio-Rad Gene Pulser MXcell电穿孔系统，对人原代成纤维细胞（Human Primary Fibroblasts，HPF）的质粒DNA和siRNA递送条件进行了优化。

1. 公开研究采用的电转条件

这组条件来自Bio-Rad特定电转平台、反应体系和细胞实验，不能直接作为其他设备的通用设置。

2. 研究报告的转染结果

研究人员在上述优化条件下，获得了以下结果：

上述结果均来自论文报告的具体实验体系。

需要区分：93%代表荧光标记siRNA递送检测结果，44%对应pEGFP质粒表达，96.1%则属于GAPDH mRNA敲低效果。这三个百分比不是同一种检测指标，不能相互替代。

该研究还提到，在其相关条件下，siRNA和质粒递送后24小时的细胞活率相近，但论文没有提供可直接引用的对应活率百分比。

因此，不能根据93%的siRNA阳性率，推断该实验同时具有93%的细胞活率。

3. 这些结果对实际实验有什么意义？

研究说明，同一种人原代成纤维细胞，在采用相同电转条件时，不同递送材料仍可能得到明显不同的结果。

因此，如果实验室已经建立了siRNA电转方案，不能仅凭这一方案的荧光阳性率，就认为对应质粒DNA也能够获得同等水平的表达。

同样，质粒DNA转染效率较低，也不能直接证明设备输出存在问题。

需要结合材料本身、胞内递送、表达及检测过程进一步分析。

五、牛胎儿原代成纤维细胞可以使用方波吗？

可以找到相关公开研究依据。

2020年发表于《BMC Molecular and Cell Biology》的研究《Systematic optimization of square-wave electroporation conditions for bovine primary fibroblasts》，系统比较了牛胎儿原代成纤维细胞的方波电转参数。

研究涉及电压、脉冲时间、脉冲次数、DNA用量、电转缓冲液、电转杯间距及操作温度等因素。

1. 研究报告的一组优化条件

这是论文报告的一组优化条件，不是全部原代成纤维细胞的最佳参数。

尤其需要注意：牛胎儿原代成纤维细胞和人原代皮肤成纤维细胞属于不同物种、不同来源的细胞，不能直接套用上述400 V方波条件。

2. 电压提高以后，效率一定更高吗？

在这项牛胎儿成纤维细胞研究中，研究人员发现，在部分实验条件下，提高脉冲电压能够增加报告基因阳性比例，但同时可能降低细胞存活。

研究还观察到，增加质粒DNA用量并不意味着结果持续改善，过高用量可能伴随明显的细胞损伤。

因此，单纯提高电压或增加质粒DNA，并不能保证最终获得更多可用的转染细胞。

3. 电转前是否必须预冷？

该研究比较了室温与预冷电转杯的条件，发现对于所研究的牛胎儿原代成纤维细胞，室温处理获得了更合适的结果。

但这不能推广为所有细胞都应在室温下电转。

具体温度应以目标细胞和实际电转协议为依据，不应直接将细菌电转常见的预冷习惯照搬到所有哺乳动物细胞。

六、为什么原代成纤维细胞电转参数存在明显差异？

2008年人原代成纤维细胞研究使用指数衰减波，而2020年牛胎儿原代成纤维细胞研究使用方波。

这并不矛盾，因为两项研究的实验对象、设备体系和目标不同。

因此，不能根据某一篇论文就认定原代成纤维细胞必须使用方波，或者必须使用指数衰减波。

对实际实验室而言，更合理的方法是优先寻找与当前细胞来源、递送材料及设备体系具有可比性的方案，再开展适当验证。

七、原代成纤维细胞电转前需要检查什么？

1. 细胞的组织来源

皮肤、肺和其他组织来源的原代成纤维细胞可能存在不同的生理特征。

开展电转前，应明确实际细胞来源，并确认相关实验结果是否适用于当前组织类型。

2. 细胞传代次数

原代成纤维细胞通常具有有限的增殖寿命。随着持续传代，部分细胞可能出现增殖速度变化、细胞衰老相关表型或其他培养特征改变。

因此，建议记录传代次数，并在具有可比性的传代范围内开展参数比较。

3. 供体及批次差异

不同供体来源的原代成纤维细胞，在增殖能力、细胞表型和研究响应方面可能存在差异。

如果实验需要比较不同供体，应尽量统一细胞处理、转染条件和检测方法。

4. 电转前活率

如果电转前已经有大量细胞死亡或状态不佳，后续电脉冲可能进一步影响可用细胞数量。

应记录电转前活率，并检查细胞是否存在异常形态、明显污染或其他培养问题。

5. 细胞收集与重悬处理

对于通常以贴壁形式培养的原代成纤维细胞，传统电转杯实验可能需要先收集细胞并制成适当悬液。

细胞脱附、离心、重悬和恢复培养本身也可能产生影响，因此需要合理设置操作对照。

6. 递送材料质量

质粒DNA、siRNA、mRNA和其他材料的递送目标并不相同。

应检查核酸纯度、保存缓冲液、实际加入量及是否具有相应功能验证依据。

八、原代成纤维细胞电转参数如何优化？

参数优化应围绕实际研究目标进行，而不是单纯追求某一个最高阳性率。

1. 电转电压应该怎样理解？

对于传统电转杯系统，名义电场强度可以表示为：

E＝V÷d

其中E表示电场强度，V表示施加电压，d表示电极间距。

例如，400 V作用于4 mm电转杯时，对应名义电场强度为1 kV/cm。

但是，不能仅凭名义电场强度相同，就认为不同设备具有相同的脉冲过程。

2. 是否需要改变脉冲时间？

脉冲时间会影响细胞接受电刺激的过程，也可能影响膜通透性和细胞损伤。

对于原代成纤维细胞，不应只观察短时间内的报告基因阳性率，还应结合细胞恢复和后续培养结果判断。

3. 是否应该增加脉冲次数？

增加脉冲次数不一定带来更好的结果。

2020年牛胎儿原代成纤维细胞研究中，部分参数条件下增加脉冲次数，并没有明显改善所评价的转染效果。

因此，应以目标细胞、设备和可靠研究结果为依据，而不是默认脉冲越多越好。

4. 电转缓冲液能否直接替换？

不同缓冲液可能具有不同的导电性和渗透压条件。

某个缓冲体系能够用于特定设备和细胞，并不代表可以直接替换到其他电穿孔仪。

尤其不能在缺乏兼容性验证时，仅为了复制论文结果而直接使用其他品牌的专用缓冲液。

九、如何评价原代成纤维细胞的电转效率和存活率？

对于原代成纤维细胞，建议至少从递送、细胞存活、恢复生长及目标功能四个层面评价实验。

1. 质粒表达阳性率

对于GFP等报告基因质粒，可通过适当的流式细胞术或荧光显微成像分析表达情况。

需要明确阳性率的统计对象是全部细胞还是存活细胞。

2. siRNA基因敲低效果

对于siRNA实验，荧光标记siRNA阳性率不能直接等同于目标基因敲低效率。

应通过RT-qPCR或其他适当方法检测目标mRNA，并根据实验需要评价蛋白表达及相关功能。

3. 细胞活率

应采用适当的细胞活率检测方法，记录实验组和对照组的结果。

对于电转后贴壁恢复较慢的细胞，仅凭一个时间点的细胞形态不能完整判断其存活状态。

4. 活细胞回收数量

如果实验需要进一步培养，应关注电转后实际能够获得的存活细胞数量。

在相同检测时间下，阳性活细胞的最终数量，有时比单独的阳性率更能反映后续实验可用性。

5. 细胞增殖及功能

对于皮肤修复、纤维化或细胞衰老研究，还需要确认电转处理是否明显改变了细胞原有的生物学特征。

例如，根据研究目的，可以进一步评价细胞增殖、细胞外基质相关表达、细胞迁移或其他功能指标。

但具体功能检测应与目标基因和研究问题直接相关，不能把所有指标都作为必须执行的统一项目。

十、二维培养与三维组织中的成纤维细胞电转一样吗？

不一样。

2024年发表于《Bioelectrochemistry》的研究《Fibroblasts transfection by electroporation in 3D reconstructed human dermal tissue》，分析了在三维重建人真皮组织中进行基因电转移的情况。

研究发现，虽然部分细胞能够被电场有效通透化，但转染细胞主要分布在组织表面。

研究人员提出，胶原蛋白丰富的细胞外基质可能限制质粒DNA在组织中的移动，从而影响更深层细胞的递送。

这一结果说明，二维悬浮细胞电转条件，不能直接推广到三维组织或完整组织模型。

如果实验室主要开展离体组织或三维皮肤模型研究，应另外查找与组织结构及电极形式匹配的实验资料。

传统电转杯设备具备细胞悬液递送功能，并不代表已经验证适用于完整三维组织中的原位电转。

十一、原代成纤维细胞电转需要哪些对照？

对于原代细胞，如果研究涉及多个供体，还应考虑供体间重复，而不是把来自同一供体的多个实验孔直接等同于独立供体重复。

如果需要比较不同传代次数，也应尽量控制递送材料、设备和其他实验条件。

十二、原代成纤维细胞电转失败，应该如何排查？

如果实验出现递送结果偏低，应先明确是细胞内递送不足，还是递送后表达或检测出现问题。

如果电转后大量细胞死亡，应重点检查电转前活率、样品处理、缓冲液和实际脉冲。

如果细胞能够存活但无法正常增殖，则应进一步评估细胞传代、培养状态和电转后恢复条件。

十三、原代成纤维细胞电转如何选择电穿孔仪？

对于主要开展原代成纤维细胞转染的实验室，选择电穿孔仪时应重点关注输出波形、脉冲时间控制、实际波形监测、电转杯规格和实验记录功能。

同时，需要确认设备所支持的波形是否与当前研究的参考方案匹配。

1. Gene Pulser 830方波电穿孔仪

威尼德Gene Pulser 830采用方波输出，官方产品资料将哺乳动物细胞、原代细胞、悬浮细胞和干细胞列为主要研究应用。

根据官网技术资料，该设备支持独立设置脉冲强度、时间、间隔和次数，并具备实时波形显示、预脉冲电阻测量、实验程序存储及历史记录查询功能。

如果实验室计划依据已有的方波研究开展原代成纤维细胞参数探索，可以结合具体细胞来源、设备技术范围和电转杯条件评估Gene Pulser 830。

这类设备的实际波形记录功能，可以帮助研究人员比较不同批次的电学条件。

但设备能够正常显示脉冲，并不代表已经完成原代成纤维细胞转染效率的实验验证。

产品详情：Gene Pulser 830方波电穿孔仪。

2. Gene Pulser X2双波电穿孔仪

Gene Pulser X2集成方波和指数衰减波两种输出方式，适合需要兼顾多种电转研究项目的实验室进行选型评估。

根据威尼德官网资料，该设备支持实际波形监测、预脉冲电阻检测、相关参数设置及多种细胞与微生物参考程序。

如果实验室既研究原代成纤维细胞的方波电转，又需要开展部分指数衰减波细胞递送或微生物电转化，可以根据实际波形需求评估Gene Pulser X2。

产品详情：Gene Pulser X2双波电穿孔仪。

3. Gene Pulser 830与X2应该怎样选择？

产品适用性说明：威尼德官网提供了上述设备的波形和技术功能资料，但本文没有引用Gene Pulser 830或Gene Pulser X2针对人原代皮肤成纤维细胞的独立转染效率及细胞活率实测数据。

因此，2008年研究中的93% siRNA荧光阳性率、44%质粒转染效率，以及2020年牛胎儿成纤维细胞的方波条件，均不能直接作为威尼德产品的实测表现或推荐设置。

十四、原代成纤维细胞电转常见问题

1. 原代成纤维细胞电转一般需要多少伏？

没有适用于全部原代成纤维细胞和设备的固定电压。公开研究存在人原代细胞的250 V指数衰减波条件，以及牛胎儿原代细胞的400 V方波条件，但两者来自不同实验体系，不能直接互换。

2. 原代成纤维细胞应该使用方波还是指数衰减波？

两种波形均有公开研究依据。具体应结合细胞来源、核酸材料及设备和缓冲体系进行选择。

3. 人原代皮肤成纤维细胞能直接使用NIH/3T3的电转参数吗？

不建议。NIH/3T3属于小鼠成纤维细胞系，与人原代成纤维细胞存在物种、遗传背景和培养特性差异。

4. 原代成纤维细胞siRNA电转和质粒电转效率一样吗？

不一定。2008年公开研究在特定条件下报告93%的荧光siRNA阳性率和44%的pEGFP质粒转染效率，说明两种材料的检测结果可能明显不同。

5. 原代成纤维细胞传代次数会影响电转吗？

可能会。原代细胞在持续培养过程中可能发生增殖和表型变化，因此应记录传代次数，并控制实验组之间的可比性。

6. 原代成纤维细胞电转后多久恢复贴壁？

没有适用于全部细胞和实验体系的固定时间。恢复情况受到细胞来源、收集方式、电脉冲条件及培养环境等因素影响，应依据目标细胞和实际方案评价。

7. 电转后GFP阳性率高，但细胞死亡很多，算成功吗？

需要根据实验目标判断。如果后续还需要培养、扩增或开展功能实验，最终可回收的阳性活细胞数量和细胞功能同样重要。

8. 原代成纤维细胞电转一定比脂质体转染好吗？

不一定。应在相同细胞和研究目标下，比较功能性递送、活率、成本和实验重复性。

9. 不同供体的原代成纤维细胞可以使用相同参数吗？

不能保证。供体差异可能影响细胞状态和实验结果。可以参考已验证条件，但仍需要根据当前细胞验证。

10. 原代成纤维细胞电转仪能够直接用于三维皮肤组织吗？

不能默认适用。传统电转杯通常面向细胞悬液，三维组织还涉及细胞外基质和电极布置等因素，需要独立的研究依据。

11. 电转仪显示正常波形，是不是代表转染成功？

不是。正常波形只说明设备执行了相应电脉冲，递送、表达、细胞活率及功能仍需通过实验检测。

十五、原代成纤维细胞电转设备与实验需求咨询

对于正在开展人原代皮肤成纤维细胞、肺成纤维细胞、牛胎儿原代成纤维细胞及其他原代细胞研究的实验室，设备选型应首先明确细胞来源、递送材料和实验目标。

如果目前遇到转染效率偏低、细胞死亡较多、恢复贴壁困难或不同批次结果不稳定等问题，建议整理以下信息：

• 细胞来源、物种及组织类型；

• 是否为直接分离的原代细胞及目前传代次数；

• 细胞培养状态和电转前活率；

• 导入质粒DNA、siRNA、mRNA还是其他材料；

• 目前使用的设备、波形、电转杯和缓冲体系；

• 已有电压、脉冲时间及次数等完整参数；

• 当前荧光阳性率、细胞活率和回收数量；

• 是否需要进一步培养、基因编辑或开展功能实验。

威尼德生物科技（北京）有限公司提供方波及双波电穿孔仪，可结合实际研究需求沟通设备规格、脉冲设置、实际输出监测和电转耗材适配问题。

方波设备：Gene Pulser 830方波电穿孔仪

双波设备：Gene Pulser X2双波电穿孔仪

在线咨询：提交原代成纤维细胞电转与设备咨询需求

联系电话：15532415159

十六、参考资料与图片来源

1. Jordan ET, Collins M, Terefe J, Ugozzoli L, Rubio T. Optimizing Electroporation Conditions in Primary and Other Difficult-to-Transfect Cells. Journal of Biomolecular Techniques, 2008;19(5):328–334。查看人原代成纤维细胞电转研究。

2. Hyder I, Eghbalsaied S, Kues WA. Systematic optimization of square-wave electroporation conditions for bovine primary fibroblasts. BMC Molecular and Cell Biology, 2020;21:9。查看牛胎儿原代成纤维细胞方波研究。

3. Albérola G, et al. Fibroblasts transfection by electroporation in 3D reconstructed human dermal tissue. Bioelectrochemistry, 2024。查看三维重建人真皮组织电转研究。

4. Supp DM, et al. Isolation and feeder-free primary culture of four cell types from a single human skin sample. STAR Protocols, 2022。查看人原代皮肤细胞来源及培养资料。

5. Fibroblasts: origins, definitions, and functions in health and disease. Cell, 2021。查看成纤维细胞来源与功能综述。

6. 威尼德生物：Gene Pulser 830方波电穿孔仪官方技术资料。

7. 威尼德生物：Gene Pulser X2双波电穿孔仪官方技术资料。

8. 图1：James J. Faust、David G. Capco，Fluorescent image fibroblast，NIH/NIGMS图像资料。查看原图及公共领域说明。

9. 图2：Richard Wheeler（Zephyris），Electroporation Cuvettes，Wikimedia Commons。查看原图；CC BY-SA 3.0授权。图片未修改。

10. 图3、图4：威尼德生物官方网站Gene Pulser 830与Gene Pulser X2产品实物图。

技术说明：本文介绍原代成纤维细胞在科研实验中的电穿孔递送、参考参数、细胞活率及结果验证方法。人原代成纤维细胞与牛胎儿原代成纤维细胞的研究数据来自不同实验体系，不能直接互换。文中第三方研究参数及效率不属于威尼德设备独立实测，也不能作为其他设备的通用推荐设置。具体应用应结合细胞来源、传代状态、递送材料、设备规格及实际验证结果确定。本文仅用于科研技术交流。