siRNA电转怎么做？参数优化与基因敲低效果验证

siRNA电转是细胞基因功能研究中常用的一种非病毒核酸递送方法。对于需要开展基因敲低、RNA干扰、细胞信号通路分析及原代细胞研究的实验室而言，通过电穿孔将siRNA导入目标细胞，是值得考虑的技术路线。

实际实验中，研究人员经常遇到以下问题：siRNA电转需要多少电压？siRNA电转和质粒DNA电转能使用相同参数吗？为什么荧光标记siRNA已经进入细胞，却没有检测到明显的基因敲低效果？

这些问题涉及两个不同环节：一是siRNA能否有效进入细胞，二是进入细胞后的siRNA能否通过RNA干扰机制降低目标基因表达。

因此，siRNA电转不能只关注递送阳性率，还需要综合评价目标mRNA水平、蛋白表达、细胞活率及后续功能。

一、siRNA电转是什么？基因敲低原理是什么？

siRNA（Small Interfering RNA，小干扰RNA）通常是长度约21—23个核苷酸的双链RNA分子，可以通过RNA干扰（RNA interference，RNAi）机制调节特定基因的表达。

人工合成的siRNA进入细胞后，可以参与RNA诱导沉默复合物（RNA-Induced Silencing Complex，RISC）的形成。

其中，具有引导作用的RNA链能够帮助相关蛋白识别互补的目标mRNA。对于具有适当互补性的靶标，Argonaute 2等蛋白可介导目标mRNA切割和降解，从而降低相应基因的表达。

需要注意：siRNA基因敲低不等于基因敲除。

siRNA主要通过降低目标mRNA及其蛋白表达发挥作用，通常不会直接改变目标基因的DNA序列。

而CRISPR-Cas9基因敲除涉及基因组靶位点编辑，两者的工作机制、实验结果及验证方式存在区别。

二、siRNA为什么可以使用电穿孔递送？

siRNA属于带有负电荷的核酸分子，难以在常规条件下高效穿过细胞膜。

实验室通常可以通过脂质体等化学转染方法，或者通过电穿孔等物理方法，将siRNA递送至目标细胞。

电穿孔通过外加电脉冲改变细胞膜通透性，为siRNA等外源分子进入细胞提供条件。

对于部分常规化学转染效率不理想的悬浮细胞、原代T细胞、原代单核细胞及其他难转染细胞，电穿孔具有公开研究支持。

但是，电穿孔并不一定比化学转染更适合全部细胞。

例如，对于部分容易使用脂质体完成siRNA转染的贴壁细胞，化学转染可能已经能够获得满足研究目的的基因敲低结果。

因此，选择电穿孔还是脂质体转染，应综合考虑细胞类型、基因敲低效果、细胞存活率和实际实验成本。

三、siRNA电转与质粒DNA电转有什么区别？

siRNA和质粒DNA都可以通过电穿孔递送，但两者的分子性质和实验目的不同。

部分厂家技术资料指出，对于同一种细胞，已经建立的质粒电转条件可以作为探索siRNA递送条件的起点。

但这并不代表质粒DNA和siRNA使用相同参数一定能够获得相同的递送或基因敲低结果。

特别是不同电转设备、电极结构和缓冲体系之间，不能直接复制专用程序。

四、siRNA电转参数应该如何选择？

siRNA电转没有适用于所有细胞和设备的统一电压。实验条件需要结合细胞状态、电转波形、脉冲时间、siRNA用量、缓冲液及电转杯规格共同确定。

对于使用传统电转杯的实验，名义电场强度通常可以通过以下关系计算：

电场强度E＝施加电压V÷电极间距d。

因此，即使两份实验资料采用相同电压，如果电转杯间距不同，实际电场条件也不相同。

Thermo Fisher Scientific的siRNA递送技术资料建议，针对较难使用常规脂质体方法转染的细胞，可以优化适当缓冲体系中的方波电压、脉冲时间及次数，并同时评价基因敲低和细胞死亡情况。

对于siRNA用量，关键不是追求更高浓度，而是寻找能够获得足够目标基因敲低、同时减少细胞损伤及非特异作用的有效范围。

重要说明：其他品牌公开的siRNA电转参数和专用缓冲液条件，不能直接视为威尼德电穿孔仪的推荐方案。具体应用需要依据设备技术规格及实验验证确定。

五、公开研究中的siRNA电转有哪些参考依据？

1. 原代T细胞siRNA递送研究

2008年发表于《European Journal of Immunology》的研究《siRNA stabilization prolongs gene knockdown in primary T lymphocytes》，使用基于电穿孔的Nucleofection方法，将siRNA递送至原代T淋巴细胞。

该研究发现，siRNA在细胞内的稳定性，是影响原代T细胞RNA干扰持续时间的重要因素。

研究还报告，在其特定条件下，经过化学修饰提高稳定性的siRNA，可使非分裂T细胞中的基因敲低效果持续最长约2周。

需要注意：这不是普通siRNA在所有T细胞中的固定作用时间，更不代表所有电穿孔仪均可实现相同结果。

2. 原代人单核细胞siRNA递送研究

2015年发表的《A procedure for efficient non-viral siRNA transfection of primary human monocytes using nucleofection》研究，使用电穿孔相关的Nucleofection技术向原代人单核细胞递送siRNA。

研究针对5-脂氧合酶（5-LO）开展实验，观察到目标mRNA下降，并进一步检测到相应蛋白水平及酶活性的降低。

这说明，评价siRNA递送是否有效，不应仅停留在核酸进入细胞这一环节，还需要结合目标分子的功能性变化判断。

3. 原代造血干/祖细胞的递送研究

发表于《Molecular Therapy - Nucleic Acids》的研究《RNA-based, transient modulation of gene expression in human haematopoietic stem and progenitor cells》，比较了不同RNA分子递送方法。

研究观察到，部分化学递送条件下，尽管荧光标记siRNA显示出较高比例的荧光阳性细胞，却未能获得相应的基因敲低效果。

进一步分析提示，部分siRNA可能停留或吸附于细胞表面，形成容易被误认为成功递送的荧光信号。

相比之下，该研究中的电穿孔方法获得了有效的siRNA介导蛋白表达降低。

这项结果具有重要的实验提示意义：荧光标记siRNA阳性，不等于目标基因已经被成功敲低。

六、siRNA电转后多久检测基因敲低？

siRNA电转后的检测时间取决于目标mRNA和蛋白的稳定性，以及细胞状态与实验目的。

mRNA表达下降和蛋白表达下降，通常不会完全同步。

Thermo Fisher Scientific的RNAi技术指南指出，部分常规siRNA转染实验可在转染后24—48小时评价目标mRNA下降，在48—72小时评价目标蛋白下降。

这些时间属于常见实验参考窗口，并非全部基因和细胞的统一检测时间。

对于半衰期较长的目标蛋白，即使mRNA已经明显下降，蛋白水平也可能需要更长时间才出现明显变化。

如果实验首次未观察到蛋白敲低，不应立即判定siRNA递送失败，应结合mRNA检测结果与蛋白稳定性进一步分析。

七、siRNA基因敲低效率应该怎样计算？

siRNA实验中的“递送效率”和“基因敲低效率”不是同一概念。

1. 递送阳性比例

如果使用荧光标记siRNA，可以分析细胞群体中检测到荧光信号的比例。

但荧光信号也可能受到细胞表面吸附、背景荧光及检测条件影响，不能直接代表功能性siRNA进入细胞质并参与RNA干扰。

2. mRNA敲低效率

对于采用RT-qPCR分析目标mRNA表达的实验，可以在使用适当内参及经过验证的分析方法后，计算目标表达量相对对照组的变化。

如果已获得可靠的相对表达量，可采用以下关系表示：

mRNA敲低率＝（1－实验组相对表达量÷对照组相对表达量）×100%。

例如，对照组归一化相对表达量为1.0，siRNA实验组为0.30，则计算得到的mRNA敲低率为70%。

该计算仅为示例，不属于任何具体设备的实测数据。

需要注意，RT-qPCR需要合理选择内参及分析方法。对于明显影响内参表达或细胞组成的实验，应首先确认归一化条件是否可靠。

3. 蛋白表达下降程度

可以根据目标蛋白性质，使用Western blot、流式细胞术或其他适当检测方法，评价蛋白表达变化。

部分研究中，目标mRNA已经明显减少，但蛋白仍然保留较多。此时可能需要结合蛋白半衰期和检测时间进一步判断。

4. 细胞活率与有效回收数量

如果电转条件导致大量细胞死亡，即使存活细胞中的目标mRNA下降明显，也可能影响后续功能实验。

因此，建议同时记录细胞活率、活细胞回收量以及目标基因敲低效果，避免单纯追求较高敲低百分比。

八、siRNA电转需要设置哪些对照组？

合理设置实验对照，能够帮助区分细胞本身状态、电脉冲损伤及siRNA序列相关的实际作用。

对于需要明确目标基因功能的研究，还可以使用不同靶位点的独立siRNA进行交叉验证，并根据实验目的考虑功能恢复实验等方法。

需要注意，非靶向siRNA对照本身也应经过适当设计和验证，不能默认所有随机序列都完全没有生物学作用。

九、siRNA电转效率低或敲低效果不好，如何排查？

如果目标mRNA未下降，应优先确认siRNA序列和功能性递送，而不是直接提高电压。

如果目标mRNA下降明显，但细胞死亡严重，应进一步评估是否能够在保持满足实验需求的敲低效果时，获得更多存活细胞。

对于难转染细胞，应特别关注细胞自身耐受性以及实际使用的电转缓冲体系。

十、siRNA电转实验如何选择电穿孔仪？

如果实验室主要研究常规容易转染的贴壁细胞，且现有化学转染方法已经能够满足敲低要求，并不一定需要更换为电穿孔。

如果研究对象包含悬浮细胞、原代免疫细胞或其他难转染细胞，则可以结合实际实验条件，评估电穿孔递送的适用性。

选择电穿孔仪时，建议重点关注波形类型、脉冲参数设置范围、实际波形监测、耗材适配及实验记录功能。

1. Gene Pulser 830方波电穿孔仪

威尼德Gene Pulser 830采用方波输出，面向哺乳动物细胞、悬浮细胞及原代细胞等研究应用。

根据威尼德官方技术资料，该设备支持脉冲时间、间隔及次数设置，具备实际波形显示、预脉冲电阻测量、实验程序保存及历史记录查询等功能。

对于需要比较方波条件、细胞活率和核酸递送效果的实验室，可以结合具体细胞类型、siRNA实验要求及设备规格进行选型。

产品详情：Gene Pulser 830方波电穿孔仪。

2. Gene Pulser X2双波电穿孔仪

Gene Pulser X2集成方波与指数衰减波两种输出方式，面向同时开展哺乳动物细胞转染与微生物电转化的实验室。

根据威尼德官方资料，该设备具备实际波形监测、预脉冲电阻检测、相关参数设置及电弧保护功能。

如果实验室既开展细胞siRNA递送研究，又有细菌、酵母等微生物电转化项目，可以结合不同项目的波形需求评估双波设备。

产品详情：Gene Pulser X2双波电穿孔仪。

产品适用性说明：上述产品官方资料可以证明相应的波形及参数设置功能，但本文没有使用威尼德设备针对特定细胞siRNA递送和基因敲低的独立实测数据。

因此，不能将第三方研究中的siRNA敲低效率直接作为Gene Pulser 830或Gene Pulser X2的性能结果，也不应将其他品牌电转程序作为威尼德设备推荐参数。

十一、siRNA电转常见问题

1. siRNA电转一般需要多少伏？

不存在适用于所有细胞和电穿孔设备的固定电压。应结合细胞类型、脉冲波形、电极间距、脉冲时间及相应缓冲体系确定实验条件。

2. siRNA电转和质粒DNA电转可以使用相同参数吗？

部分细胞可将已经验证的质粒电转条件作为siRNA实验的参考起点，但siRNA的功能性递送和基因敲低效果仍需要单独验证。

3. siRNA电转后多久检测效果？

可依据目标mRNA与蛋白的稳定性确定检测时间。部分常规实验在24—48小时检测mRNA，在48—72小时检测蛋白，但具体时间应由细胞和靶基因决定。

4. 荧光标记siRNA进入细胞就说明敲低成功了吗？

不是。荧光信号只能辅助判断递送情况，还可能受到细胞表面吸附影响。需要进一步检测目标mRNA及必要的蛋白变化。

5. siRNA电转会造成永久基因敲除吗？

通常不会。siRNA主要通过RNA干扰降低目标基因表达，不直接改变DNA序列，不能等同于CRISPR基因组编辑。

6. siRNA浓度越高，敲低效率越好吗？

不一定。过高siRNA用量可能增加细胞毒性及非特异性作用。应根据细胞和靶基因特点寻找较低的有效用量。

7. 原代T细胞和NK细胞可以进行siRNA电转吗？

已有公开研究使用电穿孔相关技术在原代T细胞和原代NK细胞中实现siRNA介导的基因表达抑制。但实验条件、细胞活率和敲低效果仍需针对具体样品验证。

十二、siRNA电转设备与实验需求咨询

siRNA电转的重点，不只是把RNA递送至细胞内部，还需要获得满足研究目标的基因敲低效果，并保留足够的存活细胞。

如果实验室正在开展siRNA基因敲低、原代免疫细胞研究或难转染细胞核酸递送，建议在沟通设备需求时提供以下信息：

• 目标细胞名称、来源及培养状态；

• siRNA类型、靶基因及实验目的；

• 现有转染方法和遇到的问题；

• 当前电转设备、波形及电转杯规格；

• 已有脉冲参数和电转缓冲体系；

• 目标mRNA、蛋白检测结果及细胞活率；

• 是否需要进一步培养或开展功能研究。

威尼德生物科技（北京）有限公司提供方波及双波电穿孔仪，可围绕具体细胞、设备波形、参数调节能力及耗材适配需求进行技术沟通。

产品中心：查看威尼德电穿孔仪型号与技术参数

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咨询电话：15532415159

十三、参考资料与图片来源

1. Thermo Fisher Scientific. Top Ten Ways to Optimize siRNA Delivery in Cultured Cells.查看siRNA递送优化技术资料。

2. Thermo Fisher Scientific. Electroporation Support—Getting Started.查看siRNA电转参数及检测时间说明。

3. Thermo Fisher Scientific. Optimizing siRNA Transfection.查看siRNA浓度与实验对照资料。

4. siRNA stabilization prolongs gene knockdown in primary T lymphocytes. European Journal of Immunology, 2008.查看原代T细胞siRNA研究。

5. A procedure for efficient non-viral siRNA transfection of primary human monocytes using nucleofection, 2015.查看原代人单核细胞研究。

6. RNA-based, transient modulation of gene expression in human haematopoietic stem and progenitor cells, 2015.查看siRNA荧光信号与功能性敲低研究。

7. Electroporation of siRNA to Silence Gene Expression in Primary NK Cells. Methods in Molecular Biology, 2016.查看原代NK细胞siRNA电转研究。

8. 威尼德生物：Gene Pulser 830方波电穿孔仪技术资料。

9. 威尼德生物：Gene Pulser X2双波电穿孔仪技术资料。

10. 图1：Singh135，SiRNA mechanism.2，Wikimedia Commons。查看原图，CC BY-SA 4.0，图片未修改。

11. 图2：Richard Wheeler（Zephyris），Electroporation Diagram，Wikimedia Commons。查看原图，CC BY-SA 3.0，图片未修改。

12. 图3、图4：威尼德生物官方网站产品实物图。

技术说明：本文介绍siRNA电穿孔递送的实验原理、参数影响因素、基因敲低验证和设备选型思路。公开研究中的基因敲低效果不代表威尼德设备实测数据，也不能作为不同设备的通用推荐条件。具体实验应结合目标细胞、核酸材料、设备规格及实际验证结果确定。本文仅用于科研技术交流。