电转参数怎么设置？RNP敲除与HDR敲入能共用吗？

电转参数怎么设置？实验室已经使用Cas9 RNP完成T细胞基因敲除，现在准备加入HDR供体DNA进行基因敲入，是否可以继续使用原来的电压和脉冲时间？如果增加供体DNA以后细胞活率下降，是不是应该立即降低电压？

在CRISPR基因编辑研究中，电转仪负责提供电脉冲，帮助Cas9 RNP及其他递送材料进入细胞。但基因敲除与基因敲入的实验目的不同，使用的递送材料和最终检测指标也不完全相同。

对于已经建立稳定RNP敲除体系的实验室，如果后续加入ssODN或双链DNA供体，原来的电脉冲程序可以作为适配性评估的参考，却不能未经验证就当作完整敲入方案。

本文以人原代T细胞CRISPR研究为例，介绍RNP单独递送与RNP联合HDR供体之间的区别，以及怎样检查电转参数、样品条件和实际编辑结果。

一、电转参数怎么设置？先明确是敲除还是敲入

CRISPR-Cas9基因编辑通常利用Cas9蛋白与向导RNA识别指定的DNA靶点，并产生相应的DNA切割作用。

如果实验采用预先组装的Cas9 RNP，就不需要先通过质粒表达Cas9蛋白。

但RNP递送进入细胞以后，最终出现何种编辑结果，还与细胞的DNA修复过程及是否提供修复模板有关。

1. RNP基因敲除

在部分敲除研究中，Cas9 RNP作用于靶点以后，细胞通过相应DNA修复途径产生插入、缺失等序列变化。

如果这些变化破坏了目标基因的正常功能，就可能获得预期敲除结果。

但检测到插入或缺失，并不意味着全部编辑细胞都已经实现功能性基因敲除。必要时仍需要蛋白表达或功能检测。

2. RNP联合供体DNA进行基因敲入

如果实验希望在特定基因组位置引入指定序列，除了Cas9 RNP，还可能需要相应的HDR供体DNA。

常见供体包括短单链寡核苷酸DNA（ssODN）和较长的双链DNA模板。

加入供体以后，递送物种类、实际DNA投入量及样品组成均可能发生变化，因此需要进一步核对电转与恢复条件。

同样使用Cas9 RNP，两类实验的区别

基因敲除（KO）

细胞 + Cas9 RNP

↓

电穿孔递送

↓

检测目标位点变化及基因功能

基因敲入（KI）

细胞 + Cas9 RNP + 供体DNA

↓

电穿孔递送

↓

检测目标序列是否正确插入

图1：Cas9 RNP基因敲除与RNP联合供体DNA进行敲入的基本区别。具体修复途径及结果取决于实验体系。

二、为什么RNP敲除成功，不代表HDR敲入也能成功？

如果当前T细胞能够通过电转获得较高的目标位点编辑率，说明相应实验体系具备开展RNP编辑的能力。

但是，在敲入实验中，细胞除了需要接受Cas9 RNP，还需要满足供体DNA递送、修复模板利用以及正确序列整合等额外要求。

因此，有些实验能够观察到明显的目标位点插入缺失，却未必得到理想的敲入结果。

这时不能只根据基因敲入率较低，就判断原来的电脉冲电压不足。

需要进一步核对供体DNA设计、序列完整性、细胞状态、样品配制以及下游检测方法。

图2：Cas9蛋白、sgRNA与靶DNA复合物示意。作者：Gerardduenas，Wikimedia Commons，CC BY-SA 4.0，原图未修改。查看图片来源及授权。

三、公开研究：为什么加入HDR供体后需要重新评价细胞活率？

Roth等人在2018年发表于《Nature》的研究《Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting》中，开展了人原代T细胞非病毒基因敲入研究。

研究人员将Cas9 RNP与线性双链DNA供体共同递送进入T细胞，在指定实验条件下实现了目标序列的定点整合。

该研究还观察到，较大双链DNA供体在某些条件下会对原代T细胞造成明显的剂量相关细胞损伤。

有趣的是，在该研究体系中，RNP与双链DNA供体同时递送时，细胞存活情况与单独递送较多双链DNA时不同。

这些结果说明，供体DNA的影响并非简单等同于“加入DNA以后，电脉冲更强”。供体本身、RNP组合及实验体系都可能影响细胞结果。

1. ssODN和较长双链DNA供体不能简单看成同一种材料

Roth等人的研究分别考察了短ssODN和较长双链DNA模板。在其指定条件下，短ssODN没有表现出与较多双链DNA相同程度的细胞毒性。

这并不意味着所有ssODN实验都不会影响细胞，也不能认为所有双链DNA供体都会导致严重损伤。

真正需要考虑的是供体类型、长度、浓度、原液组成、细胞状态及完整递送方案。

2. 同样是敲入，不同供体大小也可能影响实验方案

如果实验只需要进行少量碱基修正，可能采用与插入较大片段不同的供体设计。

较大的序列敲入不仅涉及DNA递送，还需要考虑目标位点、修复方式及后续功能验证。

因此，实验从短序列修正变为较大基因片段敲入时，应重新评估完整条件，而不是仅改变供体长度后继续使用旧程序。

四、原有RNP电转参数可以保留哪些部分？

如果实验室已经建立一套稳定的T细胞RNP敲除条件，准备增加HDR供体时，没有必要立即推翻全部操作经验。

更合适的方法是先整理原来已经验证的基础体系。

这样可以把“新增供体DNA”带来的变化单独标记出来，而不是把全部电转条件一次性改变。

五、参数设置前，为什么需要先算清供体DNA实际加入量？

部分研究人员在整理电转程序时，只记录Cas9 RNP用量和设备电压，却忽略供体DNA的实际加入体积。

如果不同批次的供体DNA浓度不同，为获得相同DNA质量所需要加入的溶液体积也可能不同。

例如，某份供体原液为1μg/μL，另一份为2μg/μL。在加入相同DNA质量时，两份原液的体积并不相同。

因此，在核对电转体系时，除了记录供体DNA质量，还应记录：

• 供体类型：ssODN、单链DNA或双链DNA等；

• 供体长度及具体序列用途；

• 供体浓度和实际加入体积；

• 原液缓冲成分及纯化情况；

• 电转反应的最终总体积；

• 是否改变细胞与RNP的原始比例。

这些信息能够帮助技术人员判断增加供体后，是否需要重新核对样品电学负载及设备工作条件。

但不能仅根据供体DNA加入量直接推算理想电转电压。

六、T细胞RNP敲除与敲入，实验结果应该怎样分别判断？

如果实验目标不同，参数是否适用的评价标准也应不同。

1. 敲除实验重点

对于RNP基因敲除，应根据研究目标检测靶位点插入缺失、目标蛋白表达变化和必要的功能结果。

如果需要功能性敲除，不能仅根据某个靶位点出现插入缺失就认定全部细胞已经完成目标功能改变。

2. 敲入实验重点

对于HDR敲入，应根据供体设计选择合适的检测方法，确认目标序列是否正确整合到指定位置。

例如，可以结合适当的连接位点检测、目标区域测序及必要的蛋白表达或功能分析。

仅检测到GFP荧光，不一定能够排除非预期表达或其他整合情况。

3. 两类实验都需要关注细胞存活

Roth等人的研究明确将敲入阳性细胞比例与实际细胞数量分开评价。

研究发现，某些条件可以提高阳性率，但不一定获得更多可用的阳性细胞。

因此，实际项目还需要关注细胞活率、活细胞回收和后续扩增能力。

七、为什么原代T细胞的激活状态不能忽略？

T细胞在不同激活和培养阶段，细胞的生理状态可能不同。

Roth等人的人原代T细胞研究中，实验人员对细胞激活、递送前状态以及电转后的培养条件进行了系统评价。

因此，如果某实验室原来使用激活后的T细胞建立RNP敲除方案，后来改用新鲜分离、未激活或其他状态的T细胞，即使递送物没有变化，也不应默认原来的电脉冲条件必然适用。

对于来源不同的原代细胞，还需要考虑供体差异、冻存复苏过程、细胞纯度和起始活率等影响。

图3：T淋巴细胞扫描电子显微镜图像。来源：NIAID / Wikimedia Commons，CC BY 2.0，原图未修改。此图不是电转后细胞的实测图。查看图片原文件。

八、需要从敲除转向敲入，推荐怎样开展参数适配？

如果已有成熟RNP敲除条件，建议围绕“增加供体DNA后，哪些实验条件发生变化”进行验证，而不是立即增加所有脉冲参数。

可以先明确三个比较方向。

实际需要哪些对照，应根据实验目的、供体类型及所采用的基因编辑技术确定。

对于珍贵的人原代T细胞，不应为了比较条件而在未经验证的范围内随意提高电脉冲电压、持续时间或重复次数。

如果设备已有成熟程序，可以先向厂家核对该程序的完整输出条件，再根据目标样品和公开研究确定是否需要进一步验证。

九、Gene Pulser 830可以怎样支持CRISPR RNP参数研究？

对于T细胞、Jurkat等免疫细胞及其他真核细胞的电转研究，设备通常需要具备与目标实验相匹配的电脉冲控制能力。

威尼德Gene Pulser 830是一款方波电穿孔仪，支持分别设置脉冲强度、脉冲持续时间、脉冲次数及间隔。

根据官网产品资料，设备具备：

• 方波脉冲参数独立调节；

• 多脉冲程序组合；

• 实际电压、时间及波形显示；

• 预脉冲样品电阻检测；

• 电弧保护及异常安全放电；

• 实验方案保存与历史记录查询。

对于需要比较RNP单独递送和RNP联合供体DNA条件的研究人员，可以通过设备程序管理保存已确认的电脉冲条件，并将对应的实际输出信息与编辑、活率及细胞回收结果建立联系。

图4：威尼德Gene Pulser 830方波电穿孔仪。查看产品原图。

需要特别说明，Gene Pulser 830具有方波输出及实验记录功能，并不代表上述2018年Nature研究是在该型号上完成，也不能将其他品牌专用电转系统的程序代码直接输入Gene Pulser 830。

如果参考方案来自使用专用电转板、专用缓冲液或特定程序代码的系统，应先向技术人员确认相关条件是否能够在当前设备上实现。

十、为什么需要特别关注实际输出与样品负载？

当实验从单独RNP递送变成RNP联合供体DNA递送以后，样品中的核酸组成及溶液条件可能发生变化。

样品电导率、电极结构和脉冲设置共同影响实际放电过程。

如果供体DNA原液含有不同的缓冲成分，或者加入体积发生明显变化，应重新核对电转液和工作体积是否符合设备要求。

对于支持预脉冲电阻检测的设备，可以将该信息作为辅助检查指标，但不能用它直接预测敲入效率或细胞活率。

如果放电出现异常中断、电弧或其他安全报警，应按照设备说明停止不安全操作，而不是为了获得更高编辑率反复提高电压。

图5：Gene Pulser 830方波电穿孔仪侧前方视图。查看产品原图。

十一、电转参数怎么设置？常见问题

1. T细胞RNP敲除已经成功，做HDR敲入还能使用原来的电压吗？

原程序可以作为参数适配参考，但加入供体以后，需要重新核对递送材料、样品组成、细胞存活及敲入结果，不能直接保证效果相同。

2. 使用ssODN和双链DNA供体，电转参数一定不同吗？

不一定需要完全不同的电脉冲设置，但两者可能带来不同的递送和细胞响应，需要结合具体条件验证。

3. HDR敲入率低，可以直接提高电压吗？

不建议直接这样判断。还需要检查供体设计、DNA质量、细胞状态、目标位点修复及检测方法。

4. RNP编辑率高，为什么细胞活率仍然可能下降？

可能与电脉冲、细胞状态、RNP组分、供体DNA、缓冲液和恢复条件等因素有关，不能仅根据编辑率确定原因。

5. 敲除率达到80%，是否表示敲入率也能达到80%？

不是。基因敲除与定点敲入涉及不同的实验终点及修复要求，不能直接换算。

6. 电转设备记录正常，为什么没有正确敲入？

电脉冲记录只能提供设备输出相关信息，不能证明供体DNA已经正确参与目标位点修复。仍需通过适当的基因组检测确认。

7. 可以直接复制Lonza的RNP程序代码到其他电转仪吗？

不能默认兼容。不同系统的脉冲控制、电极结构和缓冲体系可能不同，需要获得完整技术条件并进行适配性判断。

十二、RNP敲除转为HDR敲入，怎样向厂家咨询参数？

如果实验室已有成熟RNP电转条件，准备增加ssODN或双链DNA供体进行敲入，可以整理以下信息后联系技术人员：

• 具体细胞类型、来源及激活状态；

• 原来使用的Cas9蛋白与向导RNA体系；

• 现有电转仪型号、波形和完整脉冲记录；

• 新增加的供体DNA类型、长度、纯度及加入量；

• 电转杯规格、工作体积和缓冲液；

• 原来RNP敲除的编辑率及细胞活率；

• 当前敲入实验的结果及细胞回收情况；

• 需要解决的是参数适配、试机验证还是设备采购。

例如，可以这样向威尼德技术人员描述：

“我们实验室已建立原代T细胞Cas9 RNP基因敲除方案，现在准备增加HDR供体DNA开展基因敲入。希望先确认原来的方波条件能否作为参考，是否需要重新核对样品负载与电转杯，并了解Gene Pulser 830的参数设置、输出记录和设备适配情况。”

这种信息能够帮助技术人员围绕实际实验目标沟通设备功能，而不是只根据“RNP电转”给出一组缺少适用条件的固定数字。

如果主要需求是评估T细胞电转设备，可以参考《T细胞电转仪怎么选？基因编辑实验重点看什么？》。

如果需要了解原代细胞之间的参数差异，可继续阅读《原代细胞、免疫细胞电转参数优化：为什么不能照搬普通细胞系？》。

如果准备核对现有电转仪的参数设置能力，也可访问威尼德电穿孔仪产品中心，了解不同型号的波形与配置。

威尼德生物科技（北京）有限公司可根据客户现有RNP实验方案、供体DNA类型、细胞状态及实验结果，协助沟通电穿孔仪功能适配、参数核对与设备采购需求。

咨询RNP与HDR电转参数查看Gene Pulser 830

威尼德生物科技（北京）有限公司
技术咨询电话：15532415159

参考文献与图片来源

1. Roth TL, Puig-Saus C, Yu R, et al. Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting. Nature. 2018;559:405–409. DOI: 10.1038/s41586-018-0326-5。

2. Nature原始论文页面。人原代T细胞RNP与双链DNA供体联合递送、细胞活率和敲入效率研究。

3. Gerardduenas. Schematic Structure of the Cas9-sgRNA-DNA Ternary Complex. Wikimedia Commons，CC BY-SA 4.0。

4. NIAID. T Lymphocyte. Wikimedia Commons，CC BY 2.0。

5. 威尼德Gene Pulser 830方波电穿孔仪官方资料与对应型号产品图片。

科研与产品说明：本文的基因敲除及HDR敲入比较主要针对相关科研应用，不构成适用于所有T细胞、NK细胞或其他原代细胞的固定电转程序。Roth等人的实验使用特定Lonza设备和配套体系，其电脉冲程序不能未经确认直接迁移到威尼德Gene Pulser 830。第三方科研编辑效率与细胞活率不代表威尼德产品实测结果。外部开放授权图片如在官网不能稳定显示，建议下载后上传至本站图片库，并保留原始署名和授权信息。