电转参数优化：CHO细胞活率低，先查电压还是DNA？

电转参数已经在实验室验证成功，为什么只是把5kb质粒换成15kb质粒，细胞转染效率就明显下降？这时应该提高电压、增加脉冲次数，还是先检查质粒DNA本身？

在哺乳动物细胞转染、CRISPR基因编辑和多基因表达研究中，实验人员经常需要从常规报告质粒更换为更大的表达载体。虽然细胞类型和电穿孔仪没有变化，但大型质粒可能带来新的递送困难。

尤其是部分原代细胞、干细胞及其他难转染细胞，更换质粒以后，不仅目的基因表达率可能下降，电转后的细胞存活也可能发生变化。

本文从质粒大小与电转结果的关系出发，分析为什么不能简单通过提高电压解决大型质粒转染问题，并介绍需要核对的质粒质量、实际加入量、电脉冲条件和设备功能。

一、电转参数不变，为什么更换质粒以后结果会不同？

电穿孔通过适当电脉冲改变细胞膜通透性，为外源核酸进入细胞提供机会。

但对质粒DNA来说，实验最终获得基因表达，还涉及质粒与细胞膜的相互作用、细胞内运输、入核以及后续转录过程。

当质粒从较小的报告载体变成大型表达载体时，DNA分子的长度、构象、序列组成及实际投入分子数量都可能发生变化。

因此，同样的电转参数不一定得到相同的表达阳性率。

需要注意，5kb、10kb、15kb等大小只是描述质粒长度，并不存在适用于全部细胞的统一“大质粒”分界线。

二、相同DNA质量下，5kb和15kb质粒分子数量相同吗？

不相同。

如果两份双链DNA质粒分别为5kb和15kb，在DNA质量相同、按常规双链DNA平均分子量近似计算的条件下，15kb质粒所包含的分子数量约为5kb质粒的三分之一。

例如，两种质粒分别取相同的1μg DNA用于比较，虽然投入的DNA质量一致，但两组实际投入的质粒分子数量并不相同。

相同DNA质量下，不同质粒大小的理论分子数量

5kb质粒

理论相对分子数：3

15kb质粒

理论相对分子数：1

图1：两种质粒在相同DNA质量下的理论分子数量关系。图中圆环仅为示意，不能代表实际质粒空间结构或转染效率。

但是，不能由此直接得出15kb质粒转染阳性率一定是5kb质粒的三分之一。

实际表达结果还涉及细胞类型、质粒完整性、递送过程和转录表达等因素。

比较质粒电转时，应区分两种设计

• 等质量比较：两组加入相同质量的DNA，但质粒分子数量不同。

• 等分子数量比较：两组加入相近摩尔量的质粒，但大型质粒需要更高的DNA质量。

这两种设计可以回答不同的科研问题，不能混淆。

如果为了让大型质粒与小型质粒具有相同分子数量，就简单大量增加DNA投入，还可能同时改变DNA浓度、溶液加入体积及其他实验条件。

三、公开研究：大型质粒确实可能改变电转效率和细胞存活

Lesueur等人在2016年发表于《Molecular Therapy - Nucleic Acids》的研究《Overcoming the Specific Toxicity of Large Plasmids Electrotransfer in Primary Cells In Vitro》，分析了质粒大小与原代细胞电转结果之间的关系。

研究使用脂肪组织来源的间充质干细胞，比较了约3.5kb至16.7kb的不同质粒。

在该研究的指定电脉冲条件下，随着质粒大小增加，研究人员观察到细胞存活、转染阳性率及细胞表达水平发生明显变化。

研究还分别采用等质量和等摩尔条件进行分析，结果说明大型质粒转染困难不能完全归因于投入的DNA分子数量不同。

为什么这项研究值得关注？

它提醒实验人员：对于某些原代细胞，大型质粒带来的问题可能不仅是目的基因表达不足，还可能涉及电脉冲作用下的细胞损伤。

因此，如果原来的小质粒程序已经成功，但换成大型载体后效率下降，不能直接判断为“电压不足”。

同一研究还发现，特定电转后恢复处理能够明显改变大型质粒递送后的细胞存活结果。

需要特别说明：这属于该研究特定细胞、缓冲液和电脉冲方案下的结果，不能把论文中的恢复时间直接作为其他细胞的统一操作标准。

四、15kb CRISPR质粒电转：另一项研究发现了什么？

Søndergaard等人在2020年发表于《Communications Biology》的研究《Successful delivery of large-size CRISPR/Cas9 vectors in hard-to-transfect human cells using small plasmids》，针对大型CRISPR载体进行了电转研究。

该研究在A549等人源细胞中测试了较大的CRISPR表达质粒。

其中，在一组A549细胞实验中，单独电转15kb CRISPR-GFP质粒获得约4.2%的GFP阳性细胞，研究报告的细胞死亡比例约为91%。

在特定条件下，与3kb小质粒共同递送后，GFP阳性比例提高至约40%，细胞死亡比例下降至约45%。

图2：15kb CRISPR-GFP载体单独递送及与3kb小质粒共同递送的实验比较。来源：Søndergaard等，Communications Biology，2020，图1，CC BY 4.0，原图未修改。查看科研原图。

在后续实验中，研究人员还比较了不同大小的小型辅助质粒，以及不同大小的大型CRISPR相关载体。

研究结果支持一个重要判断：大型质粒转染结果受到DNA构建和递送体系共同影响，并不总能通过简单增加大型质粒用量改善。

但是，不能由此认为所有15kb质粒都应该额外加入3kb质粒。

加入额外质粒会改变实验组成，可能影响后续表达、基因编辑及其他生物学结果，需要结合研究目的评估。

上述数据属于第三方科研成果，不是威尼德Gene Pulser 830或其他型号的实测结果。

五、大质粒转染效率低，为什么不建议立即提高电压？

电压是电转参数之一，但转染效率不足不一定代表电脉冲强度不足。

大型质粒可能遇到分子递送、细胞内运输及细胞恢复等不同环节的问题。

如果当前电脉冲已经能够引起明显的膜通透性变化，而大型质粒的有效递送或后续表达受到其他因素限制，继续增加电压未必能够改善结果。

另外，提高电压可能同时增加细胞受到的电刺激。对于部分原代细胞和其他敏感细胞，细胞损伤可能进一步影响最终有效细胞数量。

因此，在决定是否调整脉冲强度之前，建议先区分以下情况：

这些属于排查方向，不能仅凭一种表现就确定原因。

六、更换大型质粒以后，先检查哪些DNA质量问题？

对于准备开展哺乳动物细胞大质粒电转的实验室，建议首先确认DNA样品本身是否符合实验要求。

1. 质粒大小和实际构建是否正确？

确认载体总长度、目的基因及相关表达元件。

对于包含较长插入片段、重复序列或多个表达盒的质粒，应根据项目需要确认完整性。

2. 质粒构象是否发生变化？

质粒DNA可能存在超螺旋、开环和线性等不同构象。

不同DNA构象可能影响递送和后续表达，但其影响具有实验体系差异，不能简单认为所有细胞都必须使用某一种拓扑形式才能成功。

3. DNA纯度和缓冲液是否适合当前电转体系？

Thermo Fisher的Neon NxT官方使用指南强调DNA质量及浓度的重要性，并提醒盐离子污染可能影响转染效率与细胞活率。

NEB公开电转技术资料也指出，DNA溶液中的盐及其他污染物可能影响电转过程。

因此，当大型质粒批次发生变化时，应先核对纯化方法、DNA浓度、溶液成分和加入体积。

4. 质粒加入量是否发生变化？

如果为了补偿大质粒较少的分子数量而大量增加DNA质量，实验体系可能同时发生其他变化。

特别是DNA储存液含有较多盐分或其他缓冲成分时，加入体积的增加可能影响样品电学状态。

因此，不能只记录“加入了多少微克DNA”，还需要知道DNA原液的浓度、体积和组成。

七、公开研究是否证明不同细胞都适合同一大质粒方案？

没有。

2020年Communications Biology的研究还测试了A549、HEK293、MCF7及其他人源细胞，并扩展到部分血液细胞。

研究发现，不同细胞中大型质粒递送及小质粒共同递送的效果存在差异。

图3：大型CRISPR质粒在不同细胞类型中的转染及细胞存活表现。来源：Søndergaard等，Communications Biology，2020，图2，CC BY 4.0，原图未修改。查看科研原图。

这说明，即使两个实验室使用大小相近的质粒，也不能仅凭载体长度相同就认为电脉冲程序可以通用。

对于HEK293、CHO、Jurkat及原代细胞等不同类型的实验，应分别确认目标细胞和递送材料的适配条件。

八、大质粒电转参数应该怎样开展对照验证？

如果已经有一套能够稳定递送小型质粒的成熟方案，建议先保留原始参考条件，再确认是否有必要调整。

对于希望判断“主要是质粒问题还是电脉冲问题”的实验室，可以考虑以下对照思路。

需要注意，如果大小不同的两种质粒同时具有不同启动子、不同报告基因或其他结构差异，那么结果变化不能全部归因于质粒长度。

如果希望专门研究质粒大小影响，应尽量采用具有可比性的载体设计和评价方式。

另外，初始评估不宜同时修改DNA投入量、电压、脉冲时间、电转杯和恢复培养条件。一次改变过多因素，可能导致无法解释结果变化的来源。

九、为什么大质粒电转要同时记录阳性率和细胞活率？

如果实验最终需要获得表达目标蛋白的活细胞，只看GFP阳性率可能不够。

例如，一组假设实验获得60%的GFP阳性率，但回收的活细胞明显减少；另一组条件的阳性率略低，却获得更多可以继续培养的细胞。

对于需要后续扩增、功能分析或基因编辑验证的项目，第二种条件可能更符合实际实验要求。

因此，大型质粒电转建议结合研究目标记录：

• 实际报告基因或目标蛋白阳性率；

• 电转后的细胞活率；

• 有效活细胞回收数量；

• 后续培养及恢复情况；

• 必要时的基因编辑或其他功能检测结果。

这些指标的检测时间和统计分母也应保持明确，避免将不同时间点的数据直接比较。

十、需要经常开展大质粒转染，电转仪应该具备什么能力？

对于长期开展较大表达质粒、CRISPR相关载体及其他核酸递送研究的实验室，设备选型不能只关注最高电压。

更值得确认的是：设备是否支持当前样品所需要的波形、脉冲持续时间、次数和间隔，能否核对实际输出，以及是否适配现有电转杯。

威尼德Gene Pulser 830是一款方波电穿孔仪，面向哺乳动物细胞、悬浮细胞、原代细胞及其他真核细胞电转研究。

根据官网公开资料，该设备支持：

• 分别设置方波脉冲强度、时间、次数和间隔；

• 多脉冲程序组合；

• 实际电脉冲及波形显示；

• 预脉冲样品电阻测量；

• 实验方案保存和历史记录查询；

• 电弧保护及异常安全放电。

这些功能可以帮助实验人员将大型质粒实验中的实际电脉冲记录与细胞表达、存活数据进行对应。

图4：威尼德Gene Pulser 830方波电穿孔仪。查看产品原图。

图5：Gene Pulser 830侧前方产品视图。查看产品原图。

需要特别说明，Gene Pulser 830具备相关方波参数控制和记录功能，并不代表其对15kb、20kb或其他大型质粒具有未经验证的固定转染效率。

如果已有参考文献，建议将论文完整电脉冲条件、电转杯规格及目标细胞类型提供给厂家，先核对设备能力，再讨论是否需要样品适配验证。

十一、大质粒电转参数常见问题

1. 质粒从5kb换成15kb，必须提高电压吗？

不一定。大型质粒的递送与表达可能受到多种因素影响。应先确认DNA质量、实际投入量、细胞状态与原有电脉冲是否适用，再考虑是否需要参数调整。

2. 15kb质粒是不是比5kb质粒更难电转？

部分科研研究确实观察到大型质粒的表达或细胞存活结果下降，但不能认为所有细胞和所有载体都遵循固定比例。

3. 大型质粒转染效率低，可以直接把DNA量增加3倍吗？

不建议直接这样做。增加DNA质量可能改变样品组成，并可能影响细胞耐受。需要先明确实验比较目的是等质量还是等分子数量。

4. 质粒越大，细胞死亡一定越多吗？

不一定。相关研究中的细胞损伤与具体细胞、电脉冲、DNA条件及恢复过程有关，不能将一个体系的结论直接推广至所有实验。

5. 大型质粒电转有没有统一推荐电压？

没有。应结合细胞类型、设备波形、电转杯、电转液和完整实验方案确定。仅凭质粒大小不能给出可靠的统一电压。

6. 电转仪能够显示正常波形，为什么大质粒仍不表达？

正常波形说明设备完成了相应输出，但不能证明大型质粒已经有效进入细胞并完成表达。还需要检查DNA质量、细胞内递送和载体表达能力。

7. 用大型质粒做CRISPR实验，只看GFP阳性率够吗？

不够。GFP可以提供特定表达信息，但最终仍应根据研究目的检测实际基因编辑结果、细胞存活和相关功能。

十二、向厂家咨询大质粒电转参数，需要准备哪些信息？

如果实验室原来的小质粒转染已经成功，但换成大型表达载体后出现低效率或明显细胞损伤，可以先整理以下内容：

• 细胞类型：HEK293、CHO、A549、Jurkat、原代细胞或其他具体样品；

• 原成功质粒：大小、用途、实际投入量和表达结果；

• 大型目标质粒：长度、载体类型、递送目的及DNA制备情况；

• 现有设备：型号、波形、实际电脉冲参数及相关记录；

• 耗材体系：电转杯间距、样品体积和缓冲液；

• 实验结果：目的基因阳性率、细胞活率、回收数量及检测时间；

• 实际需求：需要排查实验问题、确认设备适配、试机验证还是采购报价。

例如，可以直接描述：

“我们实验室原来使用5kb左右的GFP质粒做HEK293细胞转染，已有成熟的方波条件。现在准备换成15kb左右的CRISPR表达载体，原程序下表达率下降。希望确认现有电转参数是否适合，并了解Gene Pulser 830的脉冲调节范围、实际波形记录及设备适配方案。”

这类信息能够让技术人员先区分是DNA样品、细胞体系还是设备功能方面的问题，避免只凭“大质粒转染效率低”就推荐提高电压或更换仪器。

如果实验对象是大肠杆菌，而不是哺乳动物细胞，可阅读官网已有的《大质粒电转大肠杆菌困难？如何排查》；如果正在建立A549细胞完整的参数筛选方案，可参考《A549细胞电转参数怎么优化？三轮筛选方法》。

威尼德生物科技（北京）有限公司可根据客户提供的质粒大小、目标细胞、既有脉冲条件和实验结果，协助沟通方波电穿孔仪的技术适配、功能核对及设备采购需求。

咨询大质粒电转参数查看方波电转仪

威尼德生物科技（北京）有限公司
技术咨询电话：15532415159

参考文献及图片来源

1. Lesueur LL, Mir LM, André FM. Overcoming the Specific Toxicity of Large Plasmids Electrotransfer in Primary Cells In Vitro. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2016;5:e291. DOI: 10.1038/mtna.2016.4。

2. Søndergaard JN, Geng K, Sommerauer C, et al. Successful delivery of large-size CRISPR/Cas9 vectors in hard-to-transfect human cells using small plasmids. Communications Biology. 2020;3:319. DOI: 10.1038/s42003-020-1045-7。图1、图2，CC BY 4.0，原图未修改。

3. Thermo Fisher Scientific. Neon NxT Electroporation System User Guide. DNA质量、大型质粒及实验体系技术参考。

4. New England Biolabs. Electroporation Tips. DNA纯度、盐离子残留及电转耗材相关说明。

5. 威尼德Gene Pulser 830方波电穿孔仪官方产品资料及图片。

6. Creative Commons Attribution 4.0 International License. 本文所用Communications Biology科研图片的授权说明。

科研与产品说明：本文中的5kb与15kb对比用于说明不同质粒大小的实验问题，并非对某一具体细胞的推荐参数。第三方研究中的转染阳性率、细胞死亡率及恢复条件仅适用于各自研究体系，不能直接作为威尼德设备的实测结果或适用于其他细胞的统一操作方案。设备参数应结合目标细胞、递送材料、耗材与正式技术规格进行确认。