干细胞电转参数如何放大？细胞数量与样品体积对比

干细胞电转从20μL小样本扩大到100μL或600μL时，电压和脉冲时间需要改变吗？细胞数量增加5倍，Cas9 RNP或质粒DNA用量是否也要增加5倍？为什么小规模实验已经获得较好的编辑效率，扩大反应体积后，细胞存活率和实际回收数量却出现变化？

对于开展CD34+造血干/祖细胞、间充质干细胞（MSC）及其他干细胞电转研究的实验室来说，电转参数放大并不是简单增加细胞数量或更换更大的电转杯。细胞密度、反应体积、电极结构、递送物比例、脉冲输出和电转后恢复流程，都需要纳入验证。

本文结合公开发表的造血干/祖细胞电转研究，比较20μL、50μL、100μL及600μL等不同反应体系，介绍细胞数量与电转体积的关系，并说明如何在实验规模扩大时保持递送效率、细胞存活率和结果重复性。

一、为什么干细胞电转参数不能直接按体积放大？

在常规实验中，研究人员可能已经找到一套适合少量细胞的电转条件。例如，使用20μL反应体系能够完成CD34+细胞的Cas9 RNP递送，并获得符合预期的编辑结果。

但当实验需要处理更多细胞时，不能简单认为将样品体积扩大5倍或10倍，原有电脉冲就能保持相同效果。

1. 电转体积变化可能伴随电极结构变化

20μL反应体系通常采用特定微量电转条或专用耗材，而100μL、600μL等体系可能使用不同结构的电转杯或专用处理组件。

更换电极结构以后，实际电场分布和电流路径可能发生变化。因此，不能只比较设备设置的电压。

2. 细胞数量与细胞浓度不是同一个概念

干细胞电转实验需要区分两个参数：

• 细胞总数量：每次电转反应中包含多少个细胞；

• 细胞浓度：单位体积中包含多少个细胞，通常表示为cells/mL。

二者之间的计算关系为：

细胞浓度（cells/mL）= 细胞总数量 ÷ 反应体积（mL）

例如，200000个细胞分散在20μL电转液中，对应细胞浓度为1×10⁷ cells/mL。

如果将体积扩大到100μL，同时增加到1000000个细胞，则细胞浓度保持不变。

但细胞浓度相同，不代表新旧体系的电场、温升和递送效率必然相同。

3. 递送材料的加入比例也可能变化

电转放大时，质粒DNA、mRNA或Cas9 RNP的加入量应该按照所使用的具体实验方案进行调整。

不同体系可能按反应体积、细胞数量或者有效分子浓度设计加入量。不能不加区分地认为所有递送物都应与体积保持相同比例。

二、公开研究中不同干细胞电转体系的体积与细胞数量

从公开文献可以看出，干细胞电转并没有统一的反应体积。

下面整理几种具有明确研究来源的实验体系。

表中数据来自不同研究方案，部分细胞数量为对应文献中的典型范围，不能理解为所有设备的统一推荐容量。

此外，CliniMACS Prodigy EP-2属于用于细胞处理工艺研究的专用平台，其电转体积及性能不能直接与常规科研电转杯等同。

不同电转反应体积示意

20μL · 小体积电转条

50μL · MSC研究体系

100μL · 常见HSPC电转体系

600μL · 专用规模放大体系

图1：公开干细胞电转研究中的不同反应体积比较，条形仅表示体积大小，不代表转染效率或设备性能。

三、20μL与100μL的CD34+电转，细胞数量如何确定？

2018年发表的《CRISPR/Cas9 Genome Editing in Human Hematopoietic Stem Cells》介绍了人造血干/祖细胞的基因编辑操作。

研究人员使用Lonza 4D系统时，可以采用20μL电转条进行小规模实验，也可以使用100μL电转杯处理更多细胞。

1. 20μL小规模体系

该协议指出，20μL电转条可以处理少量CD34+细胞，研究人员曾使用约10000个细胞完成相关操作，但更倾向于使用每组100000—1000000个细胞的条件。

具体细胞数量仍需要考虑实验目的、后续检测所需样品量及细胞损失风险。

2. 100μL电转杯体系

在100μL电转杯中，原研究建议至少使用约250000个细胞，更倾向于每组500000—1000000个细胞；在该特定方法中，也讨论了更高细胞数量的使用条件。

需要注意，不同细胞数对应不同细胞浓度。如果递送材料的用量保持不变，细胞数量增加还可能改变单个细胞对应的递送物数量。

因此，从20μL扩大到100μL时，不能只调整电转液体积，还需要一起核对细胞数量、Cas9 RNP加入量和后续检测安排。

3. 细胞密度如何计算？

下面通过理论示例说明保持细胞密度时，反应体积与细胞数量之间的关系。

以上为数学换算示例，不是针对某种干细胞推荐的反应组合。

保持细胞浓度不变，只能说明每毫升细胞数量一致，不能证明不同体积、电极或设备上的电转参数可以直接共用。

四、600μL大体积CD34+电转有哪些公开实验数据？

Ureña-Bailén等人在2023年发表于The CRISPR Journal的《Automated Good Manufacturing Practice-Compatible CRISPR-Cas9 Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Clinical Treatment of β-Hemoglobinopathies》中，对CD34+造血干/祖细胞的大规模基因编辑进行了研究。

研究采用CliniMACS Prodigy平台，将小规模电转筛选扩展到较大体积的细胞处理体系。

1. 研究使用的反应体积和细胞浓度

研究中的规模放大实验采用约600μL细胞悬液，细胞浓度范围为5×10⁶—1.5×10⁷ cells/mL。

按照这一范围计算，单次600μL反应中约包含300万—900万个细胞。

递送对象包括mRNA及Cas9 RNP，具体用量则按照对应研究方法确定。

2. 研究使用的电脉冲条件

在其优化后的600μL专用电转体系中，研究使用了复合电脉冲：

• 第一段：600V，104μs，采用由8μs短脉冲构成的双极性脉冲序列；

• 第二段：200V，5000μs方波脉冲；

• 设备：CliniMACS Prodigy配套电穿孔系统；

• 递送体系：研究指定的CD34+细胞、缓冲液及Cas9 RNP条件。

这并不是普通的两次相同方波，而是由短脉冲序列和后续方波构成的特定输出方案。

该参数不能直接复制到其他方波电穿孔仪，也不能因为设备支持600V输出，就认为可以复现相同的短脉冲结构和编辑结果。

3. 不同体积下的基因编辑结果

为了验证电转体积变化的影响，研究人员在同一专用平台中比较了200μL、400μL、600μL和800μL反应体积。

实验发现，在其测试的参数和样品条件下，不同体积对应的BCL11A基因插入/缺失突变比例约为64%—66%，没有观察到明显的体积依赖性差异。

这说明在经过优化的特定设备和工艺中，可以实现一定范围内的反应体积放大。

但这一结果不能推广为“所有电转仪从200μL扩大到800μL都不需要重新调整参数”。

图2：CD34+造血干/祖细胞电转条件、RNP浓度及反应体积对编辑效率和活率的影响。原研究图1，其中F部分为200—800μL体积比较。来源：Ureña-Bailén等，The CRISPR Journal，2023，CC BY 4.0，原图未修改。

五、细胞数量增加后，Cas9 RNP需要同比例增加吗？

不能直接下结论，应根据具体实验方案判断。

在部分电转方案中，研究人员按照每次反应加入固定的Cas9与gRNA总量；在其他方案中，则按照每百万个细胞加入一定量RNP。

还有些实验在改变反应体积时，会同时按比例调整电转缓冲液、Cas9和gRNA用量。

1. 先确定原方案采用什么计量方式

例如，如果某项研究使用“pmol RNP/10⁶ cells”表示递送物比例，那么细胞数量增加后，就需要重新计算对应的RNP总量。

如果研究采用固定单孔程序，则应先核实其设计的细胞数范围及RNP加入量，而不能直接套用另一篇论文的比例。

2. DNA、mRNA和RNP不一定采用相同放大逻辑

质粒DNA常涉及分子大小、结构与DNA原液组成；mRNA还需要考虑完整性和表达时间；Cas9 RNP则需要考虑蛋白、gRNA及复合物比例。

即使三者都通过电穿孔递送，也不应使用一套统一的放大计算方法。

3. 大批量处理还需要关注操作时间

当电转量增加时，整个样品处理时间可能明显延长。

部分细胞需要长时间等待，递送物也可能在处理期间发生状态变化。

因此，大规模实验还需要确认细胞悬液稳定性、递送材料保存与操作时间，必要时设计分批电转流程。

六、干细胞电转规模放大应该按照什么顺序进行？

第一阶段：固定小规模成功条件

首先选择已经得到相对稳定结果的小规模电转方案，记录细胞类型、细胞数量、缓冲液、递送物、耗材和电脉冲设置。

同时保存对应的编辑率、转染阳性率、活率及实际细胞回收数量。

第二阶段：验证目标体积和电极体系

确认目标设备是否支持更大的反应体积，以及是否需要更换电极杯或处理组件。

如果设备和电极结构都发生变化，应将其视为需要重新验证的实验体系，而不是简单复制原电压。

第三阶段：比较小规模与放大后的结果

建议在可行情况下使用相同来源、状态接近的细胞，比较不同处理规模的结果。

重点关注：

• 电转前后实际细胞数量；

• 目标基因编辑率或转染阳性率；

• 细胞存活率；

• 有效编辑活细胞回收数量；

• 电转后的培养恢复情况；

• 不同批次之间的实验波动。

第四阶段：验证重复性和下游功能

对于需要后续扩增、克隆形成或功能研究的项目，应该在规模放大后重新评价细胞状态。

如果研究涉及CD34+造血干/祖细胞，还可以根据实验要求开展CFU等功能评价。

对于iPSC，则可能需要继续检查克隆恢复、多能性相关指标及其他质量要求。

七、扩大细胞数量后，应该怎样计算真正的有效产出？

当电转规模增加时，不应只比较“转染率是否下降”，还需要关注最终得到多少真正可用于实验的细胞。

在检测时间和统计口径一致的前提下，可以采用以下计算方法估算有效编辑活细胞数量：

估算有效编辑活细胞数 = 回收活细胞数 × 活细胞中的编辑比例

下面是假设性的计算示例，不代表任何设备的真实实验数据。

虽然假设中的放大实验活细胞回收比例和编辑比例略低，但其获得的编辑活细胞总数更多。

不过，实际研究不能只看总量，还应根据实验目的综合考虑批次稳定性、细胞功能与样品消耗。

八、干细胞电转规模放大时，设备应该重点考虑什么？

如果实验室需要从少量干细胞参数筛选逐步过渡到更多细胞的处理，设备选型不能只比较输出电压。

对于科研阶段，建议重点确认：

• 设备能够输出的波形类型；

• 电压和脉冲时间控制范围；

• 支持的电转杯间距及实际工作体积；

• 是否支持脉冲次数与间隔设置；

• 能否记录实际输出参数及波形；

• 是否具备样品电阻检测和异常放电保护；

• 是否方便保存多个实验程序；

• 是否有对应细胞与样品规模的验证资料。

威尼德Gene Pulser 830方波电穿孔仪

威尼德V-leader Gene Pulser 830面向哺乳动物细胞、原代细胞及干细胞等真核细胞的电转应用，可作为科研实验室开展方波参数开发时的设备选型参考。

根据官网产品资料，Gene Pulser 830支持方波输出，可对脉冲强度、时间、次数和间隔进行设置，并具有实际波形显示、预脉冲电阻测量和实验方案保存等功能。

这些功能有助于实验人员比较不同脉冲条件、保存已验证的科研程序，并在样品或实验条件发生变化时复核实际输出。

图3：威尼德Gene Pulser 830方波电穿孔仪，点击查看设备技术参数。

需要特别说明：Gene Pulser 830的科研级方波参数控制功能，不代表该设备已验证上述600μL CliniMACS Prodigy专用工艺，也不能将其直接视为临床级细胞制备设备。

如果实验室需要从常规电转杯扩大到更大体积，应在采购前与厂家确认具体样品处理量、电极兼容性、设备输出能力及适用的验证方案。

同时需要多种波形怎么办？

如果实验室还需要进行微生物电转化、小鼠胚胎干细胞指数衰减波研究及常规真核细胞方波转染，可以进一步了解威尼德Gene Pulser X2双波电穿孔仪。

该设备支持方波和指数衰减波输出，并兼容0.1cm、0.2cm及0.4cm常规电转杯，可用于比较不同实验场景的设备需求。

图4：威尼德Gene Pulser X2双波电穿孔仪，可用于评估不同波形研究的设备配置需求。

同样需要说明，双波设备具备多种波形输出能力，不等于已经具备特定大规模细胞生产工艺或获得所有干细胞体系的验证结果。

九、干细胞电转规模放大常见问题

1. 20μL电转成功，可以直接扩大到100μL吗？

不能直接默认成功。需要核对电极结构、设备程序、细胞浓度、递送材料比例及恢复条件。如果设备体系变化，还应重新验证电脉冲和实验结果。

2. 细胞数量增加5倍，DNA或RNP必须增加5倍吗？

不一定。不同研究按照细胞数、反应体积或特定程序设计递送物用量，应该根据原始实验协议和实际结果确定。

3. 600μL电转需要使用多少个CD34+细胞？

2023年的一项CliniMACS Prodigy研究使用5×10⁶—1.5×10⁷ cells/mL的细胞浓度，对应600μL反应中约300万—900万个细胞。该范围属于指定研究条件，不代表其他设备的标准要求。

4. 规模放大以后，电压一定要提高吗？

不是。是否需要调整电压取决于电极结构、波形、样品电学条件及设备工艺，不能因为样品体积增大就直接提高电压。

5. 放大后编辑率没有下降，是不是就算成功？

还不能直接下结论。需要进一步关注活细胞回收数量、重复性及必要的后续功能。对于涉及细胞治疗生产的研究，还必须满足相关质量体系、合规和工艺验证要求。

6. 普通科研电穿孔仪能够直接用于临床级细胞生产吗？

不能仅凭科研级设备可以完成细胞电转就得出这一结论。临床级细胞制备涉及设备适用性、过程控制、质量体系、无菌保障和相关法规要求，必须分别审核和验证。

十、干细胞电转规模放大需要提供哪些技术信息？

如果实验室已经完成少量细胞电转，希望扩大处理规模，建议在咨询设备或参数方案时提供：

• 细胞类型：iPSC、MSC、CD34+或其他细胞；

• 当前每次反应的细胞数量和样品体积；

• 目标需要处理的总细胞数量；

• 使用的质粒DNA、mRNA或Cas9 RNP；

• 现有电转设备和电极规格；

• 已验证的脉冲条件、效率及活率；

• 是否需要分批处理或扩大单次反应体积；

• 最终用途为科研实验、工艺研究还是其他应用；

• 是否需要设备演示或实际细胞样品验证。

例如，客户可以说明：“目前使用20μL反应体系进行CD34+细胞RNP电转，单次处理20万个细胞，计划增加到每次100万个以上，希望确认设备是否能够支持目标样品量，并验证电转后的编辑效率与活细胞回收。”

相比简单询问“大体积电转仪多少钱”，提供这些信息更容易确定是否需要更换电极、改变实验流程，或先开展小规模与目标规模的对比验证。

如果当前问题是不同设备上的电转参数难以复现，还可以参考《复制电穿孔参数为什么失败？电转染与电转化条件差异解析》。

如果希望了解原代细胞参数的适配方法，可以阅读《原代细胞、免疫细胞电转参数优化》。

威尼德V-leader可根据客户的样品类型、现有电转程序、目标细胞数量及实验要求，协助沟通科研电穿孔仪的参数控制能力、耗材适配性和必要的实验验证方案。

咨询干细胞电转参数查看电穿孔仪产品

威尼德生物科技（北京）有限公司
技术咨询电话：15532415159

参考资料及图片来源

1. CRISPR/Cas9 Genome Editing in Human Hematopoietic Stem Cells. 2018. 小体积与100μL CD34+电转方法。

2. Liew A, et al. Robust, Efficient, and Practical Electrogene Transfer Method for Human Mesenchymal Stem Cells Using Square Electric Pulses. Human Gene Therapy Methods. 2013.

3. Protocol for efficient CRISPR/AAV-mediated genome editing and erythroid differentiation of human hematopoietic stem and progenitor cells. 2025.

4. Ureña-Bailén G, et al. Automated Good Manufacturing Practice-Compatible CRISPR-Cas9 Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Clinical Treatment of β-Hemoglobinopathies. The CRISPR Journal. 2023;6(1):5-16. 图1，CC BY 4.0。

5. 威尼德V-leader Gene Pulser 830方波电穿孔仪产品资料及图片。

6. 威尼德V-leader Gene Pulser X2双波电穿孔仪产品资料及图片。

技术说明：本文所列细胞数量、20—600μL电转体积及相关基因编辑结果均来自不同第三方公开研究，不代表威尼德设备的实测性能。不同设备的电极结构、波形和缓冲体系可能存在差异，不能未经验证直接复制参数。涉及临床细胞制备的设备及工艺，应遵守适用法规和质量管理要求。本文仅供科研技术交流。