干细胞质粒DNA电转参数优化：浓度、脉冲与活率分析

干细胞质粒DNA电转需要加入多少DNA？电压、脉冲宽度和次数应该如何选择？为什么同一套电转条件使用GFP报告质粒时效果较好，更换成较大的目的基因质粒后，转染效率却明显下降？

对于开展间充质干细胞（MSC）、诱导多能干细胞（iPSC）、胚胎干细胞（ESC）及其他原代干细胞基因表达研究的实验室来说，质粒DNA电转参数不仅涉及电脉冲，还与载体大小、DNA质量、加入量、缓冲液、细胞状态及电转后培养密切相关。

本文结合2010年人胚胎干细胞质粒电转研究、2013年人间充质干细胞方波电转研究，以及2018年和2025年的干细胞质粒递送实验数据，说明如何正确理解公开参数，并帮助实验人员建立兼顾转染效率、细胞活率和实验重复性的优化方案。

一、干细胞质粒DNA电转为什么不能只调整电压？

质粒DNA通常是具有特定遗传元件的环状双链DNA分子。在干细胞研究中，常用于递送GFP报告基因、目的蛋白表达载体以及其他遗传研究构建体。

电穿孔通过短暂电脉冲改变细胞膜通透性，为外源核酸进入细胞创造条件。但质粒DNA进入细胞后，通常还需要到达细胞核，才能有效完成转录和后续蛋白表达。

因此，质粒电转与mRNA递送的优化重点存在差异。即使细胞膜通透性得到改善，也不能保证每一份质粒都能进入细胞核并产生预期表达。

1. 质粒DNA电转需要经过哪些关键环节？

干细胞质粒DNA电转与表达过程

质粒DNA样品

载体结构、纯度、大小、浓度及缓冲体系

↓

电穿孔递送

电压、电场强度、脉宽、次数及电极结构

↓

细胞内运输与核内表达

核内递送、启动子活性、目的基因转录与蛋白表达

↓

实验结果评价

GFP阳性率、表达强度、活细胞回收及后续功能

图1：干细胞质粒DNA电转递送及表达过程示意

如果细胞能够存活但没有明显GFP表达，可能涉及质粒质量、启动子活性、核内递送或检测时间等因素，并不能直接认定电压不足。

二、公开研究中的干细胞质粒DNA电转参数有哪些？

1. 人MSC方波电转：1500V/cm、100μs、8次脉冲

Liew等人在2013年发表的《Robust, Efficient, and Practical Electrogene Transfer Method for Human Mesenchymal Stem Cells Using Square Electric Pulses》中，研究了质粒DNA浓度与电转缓冲体系对人MSC转染效率的影响。

研究采用骨髓和脂肪来源的人MSC，通过Cliniporator设备递送pCMV-GFP质粒。

对于近似平行电极结构的1mm电转杯，1500V/cm名义电场强度相当于约150V电压。

但这一换算仅用于理解原研究参数，不代表其他设备使用150V就能够复现相同结果。

2. 增加质粒浓度，转染效率如何变化？

该研究首先使用8μg质粒DNA开展实验，随后逐步比较更高的质粒加入量。

研究发现，将质粒加入量提高至52μg后，GFP阳性细胞比例明显增加。在进一步调整缓冲液组成后，骨髓来源MSC的平均转染阳性率约为79%，脂肪来源MSC约为69%，细胞存活率约为70%。

研究中优化后的缓冲体系涉及S-MEM与水的特定比例，不能将这一条件直接视为通用电转缓冲液。

需要注意：52μg是该研究50μL体系中的特定高剂量质粒条件，不是所有干细胞电转的推荐DNA用量。对于其他细胞类型、设备和缓冲液，应单独验证DNA加入量及细胞耐受性。

3. H9人胚胎干细胞质粒DNA电转参考条件

Moore等人在2010年发表于Stem Cell Research & Therapy的研究中，采用Lonza 96孔Nucleofection系统和Neon系统，比较人H9胚胎干细胞的质粒DNA递送效果。

其中，经过进一步优化的96孔系统采用以下实验条件：

• 细胞系：H9人胚胎干细胞；

• 递送材料：pMax-GFP质粒DNA；

• 单孔细胞数量：约200000个；

• 质粒加入量：400ng；

• 细胞悬液体积：20μL；

• 电转设备：Lonza Nucleofection 96-well Shuttle；

• 电转程序：96-CB-150；

• 电转后按照研究方案转入适当培养体系。

在该优化实验中，24小时GFP阳性比例为74.2%±1.4%，电转组细胞存活指标约为73.5%±3.2%。

研究初期还比较过Neon与96孔系统，所得结果与后续优化实验不同，不能将不同细胞数量和实验条件下的阳性率混合解释。

96-CB-150属于Lonza特定设备程序代码，不是可直接输入其他电穿孔仪的电压或脉冲宽度。

三、不同干细胞的质粒DNA递送效率有多大差异？

2018年，Xu等人在Scientific Reports发表的研究中，使用专用管式电穿孔系统递送pCMV-GFP质粒，比较多种哺乳动物细胞的转染结果。

其中包括小鼠胚胎干细胞、人iPSC和人神经干细胞。

这些数值来自指定管式电转系统、细胞培养条件及pCMV-GFP载体，不能理解为三种细胞在所有设备上的固定转染效率。

图2：不同细胞的pCMV-GFP质粒电转荧光及流式分析结果。来源：Xu等，Scientific Reports，2018，图2，CC BY 4.0，原图未修改。非威尼德设备实测结果。

这项研究还说明，电极结构会影响实际电场分布。因此，普通平行电极杯与专用管式系统即使设置相近电压，也不能直接认为电脉冲条件相同。

四、质粒DNA大小与结构如何影响干细胞转染？

在实际实验中，研究人员经常发现，小型GFP报告质粒能够正常表达，而更大的目的基因表达质粒却难以获得相近阳性率。

这种情况不一定是电穿孔仪参数发生了问题，还可能与载体本身有关。

1. 质粒大小

不同质粒的长度可能从几千碱基对到更大的构建体。质粒尺寸变化会影响核酸递送、细胞内运输和表达过程。

已有研究和综述指出，载体大小、结构及序列组成均可能影响非病毒基因递送效率。较大的质粒在一些实验体系中可能更难获得理想表达。

因此，如果原本使用约5kb的GFP质粒完成参数验证，更换成明显更大的表达载体后，不应直接假设两者具有相同转染效率。

2. 超螺旋、开环与线性质粒

质粒DNA可能存在超螺旋、开环和线性等不同结构状态。

对于一般瞬时表达研究，完整的超螺旋质粒通常是需要重点关注的样品形式。但如果实验目的是稳定基因靶向或其他特殊应用，部分方案也会采用线性化DNA。

因此，质粒结构应根据具体实验目的选择，不能简单认为所有情况都必须使用同一种形式。

3. 启动子与表达盒结构

质粒已经成功进入细胞，不代表目的基因一定产生预期表达。

表达载体的启动子、增强子、目的基因序列、poly(A)信号及其他调控元件都可能影响结果。

例如，CMV、EF1α和PGK等启动子在不同细胞类型及长期表达条件下可能表现不同。

对于需要建立稳定多能干细胞表达模型的项目，还应注意启动子沉默及长期表达稳定性问题。

五、为什么质粒DNA纯度会影响电转结果？

质粒DNA电转失败时，实验人员常常优先尝试提高电压，却忽略了DNA制备质量。

实际上，核酸制备过程中残留的盐分、乙醇、蛋白杂质及其他组分都可能影响电转样品。

1. 质粒样品电导率

电穿孔仪输出电脉冲时，样品导电性会影响实际电学环境。

如果DNA原液中含有较多盐分，或者加入体积过大，可能改变样品电导率，增加异常放电、局部温升或其他实验不稳定因素。

因此，不能只关注质粒浓度，还需要核对DNA的保存缓冲液和实际加入体积。

2. DNA纯度与内毒素

用于干细胞转染的质粒应具有与研究要求相匹配的纯度。

对于对样品杂质较敏感的原代细胞，建议评估是否需要低内毒素或去内毒素级别的质粒制备方法，并按照实验要求开展相应质量检测。

需要注意，使用低内毒素DNA并不能保证电转后一定获得更高活率；细胞耐受性仍然需要结合电脉冲和完整实验条件判断。

3. 质粒浓度过高可能带来的问题

提高DNA加入量在某些研究中能够改善转染效率，但当DNA浓度很高时，样品可能变得黏稠，增加移液和混匀难度。

Liew等人的MSC研究就提到，高浓度质粒储备液具有明显黏稠性，需要注意移液准确性与气泡问题。

因此，调整质粒用量时应同时记录DNA质量、加入体积和细胞状态，而不是只看最终加入了多少微克。

六、温度与操作条件也会影响质粒电转结果吗？

会。2025年Kamenšek等人在Pharmaceutics发表的人脐带来源MSC研究中，对质粒电转条件进行了优化。

研究人员最初使用低温处理时，部分电脉冲组合获得的GFP阳性率及细胞存活结果都不理想。

随后调整实验操作条件，避免使用原先的冰浴步骤。在研究所采用的室温条件下，部分方波方案获得了明显改善的转染结果。

其中GET 1程序采用：

• 电场强度：1300V/cm；

• 对应电压：2mm电转杯约260V；

• 脉冲宽度：100μs；

• 脉冲次数：8次；

• 脉冲频率：1Hz。

在该研究的优化条件下，GFP转染效率达到约80%，细胞存活率达到约90%。

这说明电转温度和操作流程可能显著影响实验结果。

但不能据此认为所有干细胞质粒电转都应该采用室温处理。不同细胞类型、缓冲液和设备可能需要不同的样品温度管理方式，应以对应实验方案为依据。

图3：人MSC不同质粒电转条件下的GFP表达、细胞存活及显微结果。来源：Kamenšek等，Pharmaceutics，2025，图2，CC BY 4.0，原图未修改。非威尼德设备实测结果。

七、干细胞质粒DNA电转参数应该怎样优化？

对于首次开展质粒DNA电转的实验室，建议将参数优化分为三个阶段。

第一阶段：确认质粒与细胞质量

首先检查细胞来源、传代次数、电转前活率、DNA完整性、质粒大小、浓度、纯度及样品缓冲液。

如果使用GFP报告质粒开展初筛，应明确报告质粒和最终目的质粒的差异。GFP质粒的成功结果可以作为递送能力参考，但不能直接替代目的载体的实际验证。

第二阶段：比较有依据的脉冲条件

根据细胞类型、设备和参考文献选择起始条件。

对于方波系统，应记录电压、脉冲宽度、次数、间隔和电极间距。对于指数衰减波系统，还需要关注电容、实际时间常数及其他电学参数。

筛选过程中尽量保持细胞状态、DNA加入量及缓冲液一致，不建议一次同时改变多个关键变量。

第三阶段：综合评价转染效果

建议同时记录：

• 电转前细胞数量和活率；

• 电转后实际活细胞回收数量；

• GFP阳性率或目的蛋白表达比例；

• 单细胞表达强度；

• 电转后24—72小时的细胞恢复趋势；

• 长期表达、扩增或分化等下游指标。

如果实验需要建立稳定细胞模型，还应根据研究目标进一步评价基因型、克隆形成和长期表达稳定性。

八、质粒DNA电转失败，应该先排查什么？

实际排查时，应设置适当的未电转对照、仅操作对照及已验证的报告基因质粒阳性对照。

如果标准报告质粒可以正常表达，而目的质粒始终无法得到预期结果，应优先核实目的质粒本身及其表达体系，不宜立即认定电穿孔仪出现故障。

九、干细胞质粒DNA电转应该选择什么设备？

对于主要开展MSC、iPSC及其他真核细胞质粒DNA转染的实验室，电穿孔仪选择应重点考虑参数控制能力、样品适配性以及结果重复性。

需要关注的设备功能包括：

• 是否能够设置所需波形；

• 电压、脉宽及次数是否满足实验方案；

• 是否支持需要的电转杯间距与样品体积；

• 能否查看实际放电参数及波形；

• 是否具有样品电阻测量功能；

• 是否具备异常放电保护；

• 是否方便保存和调用已验证的实验程序。

威尼德Gene Pulser 830方波电穿孔仪

威尼德V-leader Gene Pulser 830是一款面向哺乳动物细胞、原代细胞及干细胞等真核细胞转染研究的方波电穿孔仪。

根据官网公开信息，Gene Pulser 830支持独立控制脉冲强度、时间、间隔和次数，并具备以下功能：

• 方波脉冲输出；

• 支持1—99个脉冲组合；

• 脉冲间隔设置范围0.001—10s；

• 10寸触摸屏；

• 支持实际电压、脉宽、间隔及波形显示；

• 支持预脉冲电阻测量；

• 支持600条实验方案保存与100条历史记录查询；

• 具有电弧保护和异常安全放电功能。

这些功能可以帮助研究人员比较不同质粒DNA电转条件，并在后续实验中核对参数与实际输出。

威尼德官网还展示了CHO-K1细胞GFP质粒转染实验数据，但这些数据对应的是CHO-K1细胞，不是MSC、iPSC或其他干细胞的实测结果。

针对具体干细胞质粒转染项目，应在采购前确认设备电压、脉宽、电转杯及耗材条件，并根据实际样品完成适配验证。不能将第三方文献中的转染效率直接视为威尼德设备的性能保证。

图4：威尼德Gene Pulser 830方波电穿孔仪正面展示，点击查看设备参数。

图5：Gene Pulser 830侧前方产品展示，用于了解设备外观及操作界面。

十、干细胞质粒DNA电转常见问题

1. 干细胞质粒DNA电转一般使用多少微克？

没有适用于所有干细胞的统一用量。公开研究中既存在以纳克计的微量质粒递送方案，也有采用数十微克质粒的MSC研究。实际用量必须结合细胞数量、样品体积、设备和缓冲体系选择。

2. 质粒越小，转染效率一定越高吗？

不一定。质粒尺寸可能影响递送和细胞内运输，但最终表达还取决于载体结构、启动子活性、细胞类型及实验条件。不能只根据大小预测具体转染率。

3. 超螺旋质粒与线性质粒可以使用相同参数吗？

不能默认通用。两者的DNA结构与实验用途存在差异，需要按照具体递送和表达目标验证。

4. 为什么质粒电转成功后没有目的蛋白表达？

可能与核内递送、启动子活性、载体设计、蛋白表达和检测条件有关。应先检查DNA及表达体系，再判断是否需要调整电脉冲。

5. 质粒DNA电转后一定会整合进基因组吗？

不会。常规非整合型质粒电转通常用于瞬时表达，不能把质粒进入细胞与基因组稳定整合等同起来。建立稳定细胞株需要进一步筛选和鉴定。

6. 不同干细胞能直接使用同一套质粒电转参数吗？

不能默认通用。MSC、iPSC、ESC以及其他原代细胞在培养状态和电转耐受性方面存在差异，应该结合具体实验系统分别验证。

十一、干细胞质粒DNA电转技术咨询需要提供什么？

如果实验室正在开展干细胞质粒转染，或者准备采购电穿孔仪，建议提前提供：

• 细胞名称：MSC、iPSC、ESC或其他细胞；

• 细胞来源、传代次数及电转前活率；

• 质粒名称、大小、结构和纯度；

• 递送目的：GFP报告基因、目的蛋白表达或稳定细胞株建立；

• 细胞数量、样品体积及DNA加入量；

• 现有设备、电转杯及缓冲液；

• 目前使用的电压、脉宽、次数及间隔；

• 转染阳性率、细胞活率及实际细胞回收数量。

例如，客户可以说明：“目前使用人骨髓MSC开展目的基因质粒电转，5kb报告质粒表达正常，但更换8kb载体后阳性率下降，希望核对质粒质量、电转参数及设备适配性。”

这类具体信息有助于判断问题来自载体本身、细胞状态、样品体系还是设备参数。

如果需要进一步了解相关细胞的电转条件，可阅读《原代细胞、免疫细胞电转参数优化》。

如果实验同时涉及质粒DNA、mRNA与CRISPR相关材料，也可以参考《A549质粒、mRNA和CRISPR电转方案有何区别？》，了解不同递送材料为什么需要分别建立实验条件。

威尼德V-leader可根据客户的细胞类型、质粒大小、实验目标及现有电转条件，协助沟通方波电穿孔设备的参数设置能力、耗材适配性和实际验证需求。

咨询质粒DNA电转参数查看电穿孔仪产品

威尼德生物科技（北京）有限公司
技术咨询电话：15532415159

参考资料及图片来源

1. Liew A, et al. Robust, Efficient, and Practical Electrogene Transfer Method for Human Mesenchymal Stem Cells Using Square Electric Pulses. Human Gene Therapy Methods. 2013;24(5):289-297.

2. Moore JC, et al. Efficient, high-throughput transfection of human embryonic stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 2010;1:23.

3. Xu X, et al. Efficient homology-directed gene editing by CRISPR/Cas9 in human stem and primary cells using tube electroporation. Scientific Reports. 2018;8:11649. 图2，CC BY 4.0。

4. Kamenšek U, et al. Antitumor Efficacy of Interleukin 12-Transfected Mesenchymal Stem Cells in B16-F10 Mouse Melanoma Tumor Model. Pharmaceutics. 2025;17(3):278. 图2，CC BY 4.0。

5. Nucleic acid delivery to mesenchymal stem cells: a review of nonviral methods and applications.

6. Christoffers S, et al. Possibilities and efficiency of MSC co-transfection for gene therapy. Stem Cell Research & Therapy. 2024;15:150.

技术说明：本文中的电脉冲参数、质粒用量、转染效率与细胞存活率均来自对应的第三方公开研究，不代表威尼德设备在MSC、iPSC或其他干细胞中的实测结果。具体参数应依据目标细胞、核酸材料、电极结构、设备能力及实验终点进行验证。本文内容用于科研技术交流。