Cas9 RNP电转后细胞死亡率高怎么办？

Cas9 RNP电转以后细胞死亡率明显升高，是参数优化过程中很常见、也很容易被误判的问题。

很多实验人员看到细胞死亡以后，第一反应是“电压太高”。但实际情况并不一定这么简单。电转前细胞状态、电压、脉冲持续时间、脉冲次数、RNP剂量、缓冲体系、样品装载以及电转后的恢复过程，都可能影响最终细胞活率。

因此，处理Cas9 RNP电转后细胞死亡率高的问题，重点不是立刻把电压降低，而是先判断细胞损伤更可能发生在哪一个环节。

一、先看细胞死亡发生在什么时间

排查Cas9 RNP电转后细胞死亡，首先应该记录死亡出现的时间，而不是只记录最终一个活率数字。

如果电转完成以后很快就出现大量细胞损伤，需要优先检查电脉冲、样品状态、缓冲体系、装载过程以及电转前细胞本身是否健康。

如果刚完成电转时状态尚可，但经过数小时或者继续培养以后死亡逐渐增加，则还需要继续检查电转后恢复、培养条件、RNP体系以及细胞本身的耐受性。

二、电转前细胞状态差，会放大后面的电转损伤

Cas9 RNP电转并不是从按下放电按钮以后才开始。

如果细胞在电转以前已经存在活率下降、培养状态异常、过度消化、机械吹打损伤或者长时间离开正常培养环境，那么细胞本身能够承受电脉冲的余量就已经降低。

对于原代细胞、T细胞、NK细胞、CD34+细胞和iPSC等体系，这一点尤其值得重视。

因此，比较不同电脉冲参数以前，至少应该记录电转前细胞活率和培养状态。

如果使用的是原代细胞或者免疫细胞，可以同时参考原代细胞和免疫细胞电转参数优化，进一步区分基础细胞状态和电脉冲造成的影响。

三、为什么电脉冲过强会导致细胞死亡？

电穿孔的目的，是通过电脉冲暂时提高细胞膜通透性，为Cas9 RNP进入细胞创造条件。

在合适范围内形成的膜通透性变化可以逐渐恢复，这属于可逆电穿孔。反过来，如果总体电刺激超出细胞可以恢复的范围，膜完整性可能持续受到破坏，进一步增加细胞死亡风险。

图1：可逆电穿孔形成的膜孔可以恢复，而刺激超过细胞耐受范围后可能出现不可逆膜损伤

图片来源：Foods 2024开放获取文献，MDPI

因此，“电转后死亡率高”不能只看电压。

电压、电场强度、脉冲持续时间和脉冲次数共同决定细胞实际受到的总体刺激。

四、编辑效率很高但活率很低，说明当前重点已经变了

如果Cas9 RNP编辑效率已经达到比较高的水平，但细胞死亡率同时明显升高，通常说明RNP递送本身已经不是当前最需要解决的问题。

此时继续加强电脉冲，可能只能换来很有限的编辑效率提升，却进一步损失大量细胞。

更合理的方向是围绕当前有效条件向相对温和的区域进行小范围调整，观察能否保留大部分编辑效率，同时明显改善细胞恢复。

五、不要只说“细胞死了”，要区分活细胞、凋亡和死亡

如果需要进一步判断Cas9 RNP电转后的细胞损伤类型，只看普通细胞计数可能还不够。

例如Annexin V与PI联合检测，可以帮助区分不同状态的细胞群体。一般情况下，Annexin V阴性、PI阴性的细胞主要属于存活群体；Annexin V阳性、PI阴性更多反映早期凋亡；Annexin V与PI双阳性则提示晚期凋亡或者膜完整性已经明显受损。

图2：Annexin V/PI流式检测示例，可用于区分存活、早期凋亡以及晚期凋亡/死亡细胞群体

图片来源：Molecules 2023开放获取文献，MDPI

这类检测的价值在于：可以帮助判断当前参数到底只是让部分细胞进入应激/凋亡，还是已经造成比较严重的膜完整性损伤。

六、缓冲体系和样品条件变化，也可能让活率突然下降

电转缓冲体系并不是与参数无关的普通液体。

不同缓冲环境可能改变样品的电学性质以及细胞对电脉冲的耐受程度。因此，如果原来已经建立了一套稳定流程，而近期突然出现死亡率升高，需要对照实验记录确认样品条件有没有变化。

七、RNP剂量增加，不一定能换来更多有效编辑细胞

当编辑效率不理想时，另一个常见做法是增加Cas9 RNP剂量。

但Cas9 RNP量并不是越多越好。尤其对于较敏感的原代细胞体系，达到一定范围以后继续增加RNP，编辑效率的提升可能逐渐变小，而细胞状态却可能进一步受到影响。

所以，如果已经出现“编辑不错、死亡很多”，除了电脉冲，也应该检查RNP剂量是否已经超过当前体系真正需要的范围。

可以用一个简单的思路进行比较：

八、细胞数量和RNP剂量要一起记录

如果每组加入相同量RNP，但细胞数量发生明显变化，那么单位细胞对应的RNP量实际上已经不同。

因此，比较不同电脉冲或者不同批次结果时，需要同时记录每次参与电转的细胞数量。

否则很容易出现“仪器参数完全一样”，但真正的实验体系实际上并不一样。

九、电转后的恢复流程也会影响最终死亡率

细胞完成电转以后仍处于应激和膜恢复阶段，因此电转后的处理也是完整实验条件的一部分。

不同实验组如果电转结束以后等待时间不同、恢复培养体系不同或者接种密度差异较大，最终活率也可能出现明显差异。

在比较Cas9 RNP电脉冲参数时，建议把电转后的恢复流程同步固定。

十、不要只测一个时间点的细胞死亡率

只在电转完成以后立即测一次活率，并不能完整判断细胞是否真正恢复。

部分细胞损伤可能在早期已经发生，而另一些细胞可能在后续培养过程中逐渐进入凋亡或者失去继续增殖的能力。

因此，更有价值的方式是根据自己的细胞体系，在固定时间节点连续观察。

图3：TUNEL时间过程检测示例说明，细胞死亡和凋亡可能随培养时间持续变化，因此不能只看单一时间点

图片来源：开放获取科研文献，PMC

十一、增加对照组，可以更快判断细胞为什么死亡

如果目前Cas9 RNP电转以后死亡严重，但不知道到底来自电脉冲还是RNP体系，可以通过简单的对照组拆分问题。

十二、四种常见结果，下一步分别怎么处理？

十三、Cas9 RNP电转死亡率高，建议按照这个顺序排查

十四、设备能够帮助解决的是参数可控和实验可重复

Cas9 RNP电转后细胞死亡率高，并不能依靠设备自动给出一个所谓的万能参数。

真正重要的是能够准确设置不同电脉冲，并知道每一次实验实际输出了什么条件。

Gene Pulser 830方波电穿孔仪可用于哺乳动物细胞、原代细胞和干细胞等方波电转，可设置脉冲时间、间隔和个数等条件，并显示实际电压、脉冲时间、间隔、个数及波形。

设备还支持预脉冲样品电阻检测、实验方案保存和历史记录查询。对于“某次活率很好、下一次突然大量死亡”这种情况，可以结合成功和失败实验的记录进一步比较。

图4：Gene Pulser 830方波电穿孔仪，可用于Cas9 RNP参数梯度筛选以及成功、失败条件的比较与复现

十五、Cas9 RNP电转后死亡率高，核心是找到损伤来自哪里

Cas9 RNP电转后细胞死亡率高，并不能简单等同于“电压太高”。

更有效的解决思路，是先确认细胞初始状态，然后依次检查样品体系、装载操作、缓冲条件、电压、脉冲时间、脉冲次数、RNP剂量以及电转后的恢复过程。

如果编辑效率已经很好但活率很低，应该优先尝试在保留有效递送的前提下减轻总体刺激；如果编辑和活率同时很低，则更应该先排查基础细胞和整个实验流程，而不是继续加强电脉冲。

同时，不建议只用一个活率数字评价细胞状态。如果实验对细胞质量要求较高，可以结合Annexin V/PI、TUNEL或者其他适合当前体系的细胞死亡评价方法，进一步判断损伤是在电转早期发生，还是在后续恢复过程中逐渐出现。

最终需要建立的，不是一组让编辑率单独达到最高的参数，而是一套能够获得足够编辑效率、保留足够活细胞，并且能够重复复现的Cas9 RNP电转条件。