Cas9 RNP电转效率低是什么原因？

Cas9 RNP电转效率低时，最容易出现的误区是直接认为“电压不够”，然后不断加强电脉冲。

实际上，Cas9 RNP实验最终得到的编辑效率，是由多个环节共同决定的。RNP有没有进入细胞、guide RNA有没有活性、Cas9与guide RNA是否正确组装、细胞状态是否正常、电转后有没有恢复，以及最终检测时间和检测方法是否合适，都可能让实验表现为“编辑效率低”。

所以真正有效的排查方法，不是直接调高电压，而是先判断问题究竟发生在哪一个环节。

一、先别调参数：先判断问题属于哪一类

Cas9 RNP电转效率低，可以先分成三个层面。

只有先判断属于哪一类问题，后面的参数调整才有方向。否则很容易出现已经不是递送问题，却还在继续增加电压的情况。

二、细胞状态不好，可能从一开始就限制了编辑效率

Cas9 RNP电转依赖健康、状态相对稳定的细胞。

如果细胞在电转前已经出现活率下降、过度融合、长时间培养、解离损伤或者原代细胞状态不一致，那么后面的RNP递送和恢复都会受到影响。

特别是T细胞、NK细胞、CD34+细胞、iPSC以及其他原代细胞，不同培养阶段和供体之间可能存在明显差异。

因此，Cas9 RNP效率下降以后，首先应该查看的是电转前细胞，而不是仪器。

对于原代细胞，可以结合原代细胞和免疫细胞电转参数优化一起判断细胞状态与电脉冲之间的关系。

三、RNP进入细胞，不代表Cas9一定能够正常编辑

电穿孔解决的主要是递送问题。

电脉冲使细胞膜短时间产生通透性变化，让Cas9 RNP获得进入细胞的机会。但RNP进入以后，还需要完成目标DNA识别、Cas9切割以及后续DNA修复。

图1：Cas9 RNP进入细胞后仍需要完成靶DNA识别与切割，因此递送效率和最终编辑效率不是同一个指标

图片来源：Wikimedia Commons

所以，如果能够证明RNP或者类似大分子递送已经正常，但基因编辑仍然很低，就应该开始检查guide RNA和RNP本身，而不是继续单纯增加电脉冲。

四、guide RNA活性不足，是低编辑效率的重要排查方向

不同guide RNA即使针对同一个基因，实际编辑活性也可能不同。

guide序列的靶向能力、目标位点以及序列本身的特征，都可能影响Cas9最终编辑效率。

因此，如果已经基本排除电转递送问题，但编辑率长期偏低，可以考虑：

如果三个guide只有其中一个能够稳定获得较高编辑率，而电脉冲完全相同，那么问题显然不应该继续归因于电转仪。

五、Cas9和guide RNA组装不稳定，也会让效率下降

Cas9 RNP不是把Cas9蛋白和guide RNA随意加入细胞就可以。

正式电转以前，Cas9与guide RNA需要按照既定实验方案形成相对稳定的RNP复合物。

如果不同实验之间RNP浓度、组装比例、混合方式或者等待时间不断变化，即使使用完全相同的电脉冲参数，最终结果也可能波动。

如果RNP本身每次都不一样，后面的电脉冲参数就失去了可比性。

六、电刺激太弱，RNP可能根本没有获得足够递送

如果细胞活率一直很好，但Cas9 RNP编辑效率始终很低，那么确实需要考虑电脉冲刺激不足。

电脉冲太弱时，细胞膜通透变化可能不足以支持足量RNP进入细胞。

这种情况下可以围绕已有条件进行小范围参数优化，而不是直接跨越很大的电压范围。

图2：电脉冲需要在细胞膜形成合适的瞬时通透状态，刺激过弱可能导致Cas9 RNP递送不足

图片来源：Wikimedia Commons

但这里要注意：不能只调整电压，还需要结合脉冲宽度、次数、间隔以及实际样品体系一起判断。

七、电刺激太强，同样可能表现为“编辑效率低”

这听起来有些矛盾，但实际实验中确实存在这种情况。

如果电脉冲刺激过强，大量细胞在电转后死亡或者无法正常恢复，那么即使一部分存活细胞完成了编辑，最终能够用于检测的细胞数量也可能很少。

尤其如果检测样本本身已经因为大量细胞死亡而受到影响，最终数据可能更加不稳定。

八、细胞数量与RNP剂量不匹配，也会影响编辑结果

Cas9 RNP剂量不能脱离细胞数量单独理解。

例如同样加入一定量RNP，如果一组细胞数量明显增加，那么单位细胞对应的RNP量实际上已经改变。

反过来，如果RNP量不断增加，也不代表编辑效率会一直等比例增加。达到一定范围以后，继续增加RNP可能收益有限，同时还可能增加细胞压力。

九、气泡、样品体积和缓冲体系，都可能让“同一参数”变成不同实验

Cas9 RNP效率突然下降时，还需要检查实验操作本身。

电转样品中的明显气泡可能干扰正常放电，并降低细胞活率和递送效果。不同体系体积、不同电转耗材或者缓冲条件发生变化，也会降低实验之间的直接可比性。

因此，如果原来一直能够成功，突然某批实验效率明显下降，建议先查看最近是否发生了这些变化：

十、电转后恢复不好，也会拖低最终结果

电脉冲结束并不等于实验结束。

Cas9 RNP进入细胞以后，细胞还需要恢复、继续培养，并最终完成编辑结果的形成。

如果电转后细胞长时间停留在不合适的环境中，或者恢复培养过程不稳定，最终能够参与编辑和检测的健康细胞数量可能下降。

因此，不同参数组除了电脉冲本身，电转后转移时间、培养基、细胞密度和检测时间也应该尽量标准化。

十一、检测时间太早，也可能误判为Cas9 RNP效率低

另一个经常被忽略的问题是检测时间。

电转结束以后，RNP需要完成DNA识别、切割和细胞自身DNA修复，然后才能形成最终能够检测到的编辑结果。

如果检测时间点太早，实际编辑过程可能还没有充分表现出来。

图3：Cas9切割以后还需要经过细胞DNA修复过程，因此检测时间也是编辑效率评价的一部分

图片来源：Wikimedia Commons

另外，DNA水平的编辑结果和蛋白表达变化也不一定在同一个时间点达到稳定状态。因此，检测时间应根据具体检测指标设计，而不是所有实验统一使用一个固定时间点。

十二、最有效的办法：增加对照组，把问题拆开

如果一套Cas9 RNP实验失败，却没有合适的对照组，那么后面很难准确判断问题。

参数开发阶段可以根据实验目的设计不同对照，让每一组承担一个明确的排查功能。

十三、Cas9 RNP效率低，建议按照什么顺序排查？

这个顺序的好处是，不会一看到效率低就直接增加电脉冲，从而把原本的RNP或细胞问题进一步放大。

十四、参数重复性差时，设备记录能力也很重要

如果Cas9 RNP效率并不是一直低，而是“这次高、下次低”，就需要进一步关注实验条件是否真正被重复出来。

Gene Pulser 830方波电穿孔仪支持方波电转，可对脉冲时间、间隔和个数进行组合设置，并显示实际电压、脉冲时间、间隔、个数以及波形。

设备同时支持预脉冲样品电阻测量、实验方案保存和历史记录查询。对于Cas9 RNP实验，这些功能更适合用于保存成功与失败条件，并比较不同样品或者不同批次之间是否出现异常。

图4：Gene Pulser 830可用于Cas9 RNP方波参数筛选、实际脉冲结果查看以及实验条件复现

十五、Cas9 RNP电转效率低，核心不是“继续加电压”

Cas9 RNP编辑效率低并不等于电穿孔参数一定太弱。

真正有效的排查方法，是把完整实验拆成细胞状态、RNP、递送、恢复和检测几个独立环节。

如果细胞活率很好但编辑低，可以重点检查RNP递送、guide RNA和目标位点；如果编辑低同时细胞死亡严重，则应该先检查细胞状态、整体电刺激、缓冲体系和操作过程；如果过去成功但近期重复性突然下降，则应该重点比较不同批次的样品条件和实际脉冲记录。

只有明确问题发生在哪一步以后，再进行针对性优化，才能减少没有方向的参数试错。