PBMC电转怎么做？细胞分选与转染结果分析

PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cells，外周血单个核细胞）是免疫学、基因功能研究、细胞信号转导及基因编辑实验中常见的研究样品。对于需要将质粒DNA、mRNA等外源分子导入PBMC的实验人员而言，电穿孔是一种可以考虑的递送方法。

但PBMC电转与常规细胞系转染存在明显区别。PBMC由不同免疫细胞亚群组成，不同样品的细胞状态、组成比例和电脉冲耐受性可能存在差异。

实际实验中，研究人员可能遇到PBMC整体转染效率偏低、电转后细胞活率下降、目标T细胞阳性率不足，或同一套实验条件在不同供体样品中表现不一致等问题。

因此，PBMC电转不能只关注电压和转染阳性率，还需要根据实验目标，综合考虑细胞组成、递送材料、脉冲条件及电转后细胞功能。

一、PBMC包含哪些细胞？为什么会影响电转结果？

PBMC是从外周血中分离获得的单个核细胞群体，主要包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞和单核细胞等。

不同细胞亚群在细胞大小、激活状态、膜特性及外源分子递送表现方面可能存在差异，因此同一电转条件并不一定能够在所有亚群中产生相同结果。

另外，PBMC样品还可能受到供体来源、血液处理时间、细胞分离方式、冻存复苏以及样品纯度等因素影响。

对于需要进行PBMC电转的实验室，首先应明确研究对象是完整PBMC混合群体，还是其中某一种免疫细胞。

例如，如果实验主要研究CD3阳性T细胞，那么电转后整个PBMC群体的阳性率，并不能直接代表目标T细胞的实际递送效率。

二、PBMC电转前需要先分选细胞吗？

是否进行细胞分选，取决于具体研究目标，不存在适用于所有PBMC电转实验的统一方案。

1. 混合PBMC整体研究

对于需要观察PBMC整体反应的研究，可以考虑使用未经亚群分选的混合样品进行电转，并在后续通过流式细胞术等方法分析不同免疫细胞的表现。

2. 特定T细胞或NK细胞研究

如果实验目标明确限定为T细胞、NK细胞等特定亚群，可以根据实验设计考虑预先富集或分选目标细胞。

但细胞分选本身可能增加操作应激，因此需要同时评价分选前后的细胞活率与状态。

3. 不同供体样品比较

如果实验需要比较不同供体之间的电转结果，应统一样品处理和检测流程，并记录不同供体的细胞组成及起始活率。

三、PBMC电转前需要检查哪些条件？

1. 细胞来源及样品状态

PBMC通常来自外周血样品。实验前应明确样品来源、分离方式以及是否经过冻存复苏。

新鲜PBMC与冻存复苏PBMC可能具有不同的细胞状态，因此不建议在未进行验证的情况下直接共用全部实验条件。

2. 细胞存活率

电转前细胞活率是判断样品是否适合继续实验的重要参考。如果电转前已存在明显细胞死亡，电脉冲处理后可能进一步增加细胞损失。

3. 细胞数量及组成

PBMC属于混合细胞群体。即使两个样品的总细胞数量相同，其中T细胞、B细胞、NK细胞及单核细胞的实际数量也可能不同。

因此，应根据实验目标确认目标亚群是否具有足够的细胞数量，而不是只记录PBMC总细胞数。

4. 递送材料类型

PBMC电转可能涉及质粒DNA、mRNA及其他外源分子。不同递送材料在分子结构、作用方式和检测方法方面存在差异。

例如，质粒DNA转染通常关注报告基因表达；mRNA递送可能关注短期蛋白表达；基因编辑实验则需要进一步检测目标基因是否发生预期变化。

因此，不应认为同一套参数必然适用于全部递送材料。

四、PBMC电转参数应该怎样优化？

PBMC电转参数的选择，需要同时考虑递送效率和细胞存活率。对于后续还需要培养、扩增或进行功能研究的细胞，仅追求较高的阳性率并不一定能够获得理想结果。

需要特别注意：电压并不是一个能够独立决定PBMC电转效果的参数。即使设置相同电压，如果电转杯电极间距、缓冲液或脉冲时间发生变化，实际实验条件也可能不同。

对于其他品牌设备公开的电转程序，应首先核实其波形、专用缓冲液、反应体积、电极间距及程序设置方式，不能直接将程序编号作为威尼德设备的推荐参数。

五、PBMC电转效率应该怎样判断？

在PBMC电转实验中，建议至少区分总体递送结果、目标细胞亚群递送结果和细胞存活情况。

1. 整体转染阳性率

整体阳性率可以用于评价混合PBMC群体中的报告基因表达情况，但统计时必须明确分析分母，以及是否已排除细胞碎片和死亡细胞。

2. 目标细胞亚群阳性率

如果研究重点为T细胞，应进一步分析目标T细胞群体内部的阳性比例，而不能直接以全PBMC的阳性比例代替。

3. 细胞存活率

通过适当的活死细胞检测，评价电转后细胞损伤程度。不同实验组应尽量保持一致的检测时间和方法。

4. 阳性活细胞回收数量

对于需要后续培养和功能分析的实验，实际获得多少可用的阳性活细胞，是重要的评价指标。

例如，一组实验虽然获得了较高的转染阳性比例，但细胞死亡严重；另一组阳性比例略低，却保留了更多可以继续培养的目标细胞。

对于某些后续实验而言，第二组可能更符合实际研究需求。

六、公开研究中的PBMC电转结果说明了什么？

2009年发表于《PLOS ONE》的研究《Combined Pulse Electroporation – A Novel Strategy for Highly Efficient Transfection of Human and Mouse Cells》分析了不同电脉冲组合下的细胞转染表现。

研究涉及混合PBMC中的不同免疫细胞亚群。研究人员观察到，在所测试的条件下，不同亚群的回收情况存在差异，其中CD19阳性B细胞的比例下降较明显，反映其对相应处理条件具有较高敏感性。

这说明，PBMC电转不仅需要关注总体阳性率，还应该关注不同细胞亚群的保留情况。

2022年发表的另一项PBMC DNA修复能力研究，采用Lonza 4D-Nucleofector设备及对应试剂体系优化转染实验。在该研究的特定报告检测体系中，PBMC转染效率分别观察到约15%—45%和30%—40%的范围。

需要说明：上述实验结果均来自相应研究所使用的设备与试剂体系，不属于威尼德电穿孔仪实测数据，也不能直接作为其他设备的推荐效率。

七、PBMC电转效果不理想，应该先排查什么？

如果需要进一步了解原代细胞为什么不能直接照搬常规细胞系的电转参数，可参考威尼德官网已有技术文章：原代细胞、免疫细胞电转参数优化：为什么不能照搬普通细胞系？

八、PBMC电转实验如何选择电穿孔仪？

对于计划开展PBMC及其他免疫细胞研究的实验室，电穿孔仪选型需要结合研究目标和实际实验要求，不能仅通过设备支持的最高电压判断是否合适。

重点可关注设备波形、脉冲参数设置、实际输出监测、电转杯适配及实验程序记录等方面。

1. Gene Pulser 830方波电穿孔仪

威尼德Gene Pulser 830采用方波输出方式，支持脉冲时间、间隔及次数的组合设置，并具备实际波形显示、预脉冲电阻测量和实验方案存储等功能。

对于需要进行方波参数比较的细胞转染实验室，可结合具体样品和参考协议评估该设备。

产品详情：Gene Pulser 830方波电穿孔仪

2. Gene Pulser X2双波电穿孔仪

Gene Pulser X2集成方波与指数衰减波两种输出方式，可用于不同样品和实验体系的波形选择。

该设备具备实时波形监测、预脉冲电阻检测及参考程序设置等功能。对于同时开展细胞转染与微生物电转化的实验室，可结合项目范围进行设备选型。

产品详情：Gene Pulser X2双波电穿孔仪

产品适用性说明：设备具有相应波形和参数设置能力，不代表已经获得特定PBMC样品的转染效率或细胞活率实测结果。实际适用性及参数需要结合实验体系验证。

九、PBMC电转常见问题

1. PBMC电转和Jurkat细胞电转一样吗？

不一样。Jurkat属于长期培养的人源T细胞系，而PBMC是包含不同免疫细胞亚群的混合样品，不能直接认为两者具有相同的电脉冲耐受性。

2. PBMC电转前必须分选T细胞吗？

不一定。如果研究目标是混合PBMC整体反应，可以考虑直接使用混合样品；如果研究特定亚群，则需要根据实验目标选择是否进行富集、分选或独立门控分析。

3. PBMC电转有统一推荐电压吗？

没有适用于所有PBMC样品及设备的通用电压。需要结合电转波形、电极间距、缓冲液、细胞状态和递送材料等因素确定实验条件。

4. PBMC转染阳性率越高越好吗？

不一定。还需要结合细胞存活率、目标亚群阳性率、实际回收的阳性活细胞数量及后续功能综合判断。

5. PBMC电转后的检测时间如何确定？

检测时间应根据递送材料及实验目标确定。质粒表达、mRNA表达和基因编辑属于不同检测场景，不宜机械使用同一个时间点。

十、PBMC电转设备与实验需求咨询

PBMC电转涉及不同免疫细胞亚群，实验室在选择设备及设计实验条件时，应先明确细胞类型、样品来源、递送材料和最终实验目标。

如果目前存在PBMC转染效率偏低、细胞活率下降、不同供体结果波动或参数难以重复等问题，可以结合已有实验数据进行分析。

威尼德生物科技（北京）有限公司提供方波和双波电穿孔仪，可围绕实际研究需求沟通设备技术参数、脉冲输出方式以及实验条件验证方案。

了解更多：威尼德电穿孔仪产品中心

实验与设备咨询：在线提交咨询需求

联系电话：15532415159

十一、参考资料与图片来源

1. Combined Pulse Electroporation – A Novel Strategy for Highly Efficient Transfection of Human and Mouse Cells. PLOS ONE, 2009.查看研究原文。

2. DNA Repair Capacity for Personalizing Risk and Treatment Response – Assay Development and Optimization in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells, 2022.查看研究原文。

3. 威尼德生物：Gene Pulser 830官方技术资料；Gene Pulser X2官方技术资料。

4. 图1：Wikimedia Commons，KnuteKnudsen，CC BY 3.0。

5. 图2：Wikimedia Commons，Echinaceapallida，CC BY-SA 4.0。

6. 图3：Wikimedia Commons，Extrabodyprosím，CC BY-SA 4.0。

7. 图4、图5：威尼德生物官方网站产品实物图。

技术说明：本文用于介绍PBMC电转的实验设计、参数影响因素、结果评价及设备选型思路。文中第三方实验结果不属于威尼德设备实测，具体参数和产品适用性应以实际验证为准。本文仅面向科研实验。