PBMC电转效率低怎么办？细胞亚群分析与条件优化

PBMC电转效率低，为什么不能只看整体转染率？

PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cells，外周血单个核细胞）是免疫学、细胞功能研究和基因编辑实验中常见的原代细胞材料。实验人员可根据研究目标，尝试通过电穿孔向PBMC递送质粒DNA、mRNA或基因编辑相关组分。

但PBMC电转与常规单一细胞系转染存在明显区别：PBMC并不是一种细胞，而是由多种免疫细胞组成的混合群体。

在实际实验中，可能出现整体转染阳性率较高，但目标T细胞表达不足；或者整体细胞活率尚可，单核细胞却损失明显的情况。

因此，PBMC电转需要解决的不只是外源分子能否进入细胞，还包括目标细胞是否成功递送、细胞能否存活，以及是否获得足够数量的可用细胞。

一、PBMC包含哪些细胞？为什么会影响电转结果？

PBMC主要包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞和单核细胞等免疫细胞群体。不同细胞具有不同的生物学特征，对培养条件、外源分子递送和电脉冲处理的响应可能不同。

研究人员如果只检测PBMC整体群体的荧光阳性率，可能无法判断具体是哪类细胞获得了较好的递送结果。

例如，实验目标是向CD3阳性T细胞递送mRNA，但检测时将全部PBMC作为统计对象，就可能受到B细胞、NK细胞和单核细胞比例变化的影响。

2010年发表在PLOS ONE上的一项研究，对混合PBMC中的T细胞、B细胞及单核细胞进行了分群分析。研究发现，在该研究所采用的特定电脉冲条件下，不同亚群的回收和转染表现存在差异，部分单核细胞损失较为明显。

这说明PBMC整体结果不能直接代表每一种免疫细胞的电转效果。不过，该研究采用的设备和脉冲体系具有特定条件，不能将其中的结果直接作为其他电穿孔仪的性能数据。

二、PBMC电转前，首先检查哪些样品条件？

1. 区分新鲜PBMC与冻存复苏PBMC

新鲜分离PBMC和冻存复苏PBMC可能具有不同的细胞状态。冻存、复苏以及后续培养处理，均可能影响活细胞回收及各免疫细胞亚群的比例。

因此，电转实验应记录样品是新鲜分离还是冻存复苏、复苏后的培养情况、实验前细胞活率及实际回收数量。

如果实验需要比较不同批次，应尽量保持样品处理流程一致，避免将样品前处理差异误认为脉冲参数差异。

2. 检查分离后的细胞质量

PBMC通常可以通过密度梯度离心等方法从外周血中分离。样品质量可能受到分离操作、处理时间、细胞损伤及残留其他血液成分等因素影响。

电转前应结合细胞计数和活率检测检查样品状态，并关注细胞团聚及其他可能影响电转体系的情况。

如果样品中存在明显细胞损伤或异常团聚，应先排查分离和处理环节，而不是直接增加电脉冲强度。

图1：PBMC密度梯度分离示意图，用于说明血液样品分层与单个核细胞分离原理，不代表电转实验数据。来源：NIAID/NIH BioArt，Ryan Kissinger，美国公有领域资料。查看及下载原图｜查看图片来源

3. 确认细胞是否经过激活或扩增

部分PBMC实验使用未经激活的混合细胞，另一些实验则经过特定刺激、培养或扩增。

这些处理可能改变细胞状态和群体组成，因此不能默认静息PBMC、激活PBMC和富集后的T细胞适用相同电转条件。

实验记录中应明确样品是否经过激活，以及后续是否针对某一特定细胞亚群进行研究。

4. 核对递送材料及缓冲体系

质粒DNA、mRNA和Cas9 RNP等递送材料在分子结构、纯度要求及后续检测目标方面存在区别。

同时，电转杯间距、缓冲液、样品体积、细胞数量和样品电学特性都会影响实际电脉冲条件。

因此，参考其他实验室的PBMC电转方案时，不应只复制电压，而应确认完整实验体系。

三、直接电转混合PBMC，还是先分离目标细胞？

这是开展PBMC电转之前值得明确的问题。

如果研究目标是观察混合免疫细胞群体对某种处理的整体响应，可以考虑在适当验证后直接对混合PBMC进行处理，并在后续检测中区分细胞亚群。

如果实验目标是获得特定T细胞、B细胞或NK细胞的表达及编辑结果，则可以评估先进行细胞富集或分选是否更符合研究要求。

两种方式没有绝对的优劣，应根据实验目标、样品数量及检测能力选择。

如果先分选细胞，还需要评估分选处理本身对细胞活率、激活状态及后续功能的影响。

四、PBMC电转效率应该怎样正确计算？

PBMC电转结果分析容易出现的问题，是将整体转染阳性率直接当作目标细胞群的阳性率。

如果研究目标是CD3阳性T细胞，应在合理的检测体系中先识别目标T细胞群，再分析其表达或编辑结果。

对于需要区分不同免疫细胞亚群的实验，可以根据研究方案，使用流式细胞术进行相应的群体分析。

1. 明确目标细胞群体

例如，人PBMC中的T细胞通常可以通过CD3等标志进行识别；B细胞常使用CD19等标志；单核细胞可结合CD14等标志；NK细胞则需要根据研究体系采用适当的标志组合。

实际分析应结合单细胞筛选、活细胞识别及细胞群体特征，并注意电转处理或激活过程可能改变部分表面标志的表达。

上述标志仅用于说明分群思路，并不是适用于所有实验的完整流式门控方案。

2. 区分整体阳性率与亚群阳性率

建议至少区分以下指标：

• PBMC整体群体中的目标表达阳性比例。

• 目标免疫细胞亚群中的表达阳性比例。

• 目标亚群电转后的细胞活率。

• 最终回收的目标阳性活细胞数量。

如果实验还涉及基因编辑，应使用相应的方法确认实际编辑结果，不能只凭报告基因表达推断编辑效率。

3. 重视目标阳性活细胞数量

假设两组PBMC实验得到相似的目标亚群阳性率，但其中一组在电转后损失了大量目标细胞，那么两组最终获得的可用细胞数量可能相差很大。

对于后续需要进行扩增、分选或功能实验的项目，应同时关注目标亚群的回收数量、存活情况及表达结果。

单独一个整体PBMC阳性率，并不足以评价目标免疫细胞的实际电转效果。

五、PBMC电转常见问题应该怎样排查？

对于混合PBMC样品，建议先检查各亚群在电转前后的实际数量，再判断是否需要调整脉冲参数。

如果某一亚群大量减少，仅比较电转后仍然存活细胞中的阳性比例，可能掩盖实际细胞损失。

六、PBMC电转参数优化，需要注意哪些原则？

PBMC电转涉及细胞状态、波形、电压、脉宽、脉冲次数、缓冲液、电转杯及递送材料等多个因素。

不同研究可能针对混合PBMC、富集T细胞或其他特定亚群开展实验，因此不存在一组能够直接适用于所有PBMC样品的通用电压。

开展参数比较时，应首先确定研究对象和实验终点，再选择与实际设备及耗材相匹配的可信参考方案。

实验条件比较应尽量保持细胞来源、前处理、递送材料、检测时间和其他关键变量一致，并设置适当的未处理对照、模拟电转对照及必要的阳性对照。

对于涉及不同供体的实验，可以优先在同一供体来源的样品中进行配对比较，再观察不同供体之间的重复性。

同时需要明确：文献中其他品牌设备所使用的波形或电压，不能未经确认就直接作为威尼德电穿孔仪的推荐参数。

关于原代免疫细胞如何建立参数优化范围，还可以参考原代细胞、免疫细胞电转参数优化：为什么不能照搬普通细胞系？。

七、威尼德Gene Pulser 830适合哪些PBMC相关电转研究需求？

如果实验室正在评估PBMC或其他原代免疫细胞的方波电转研究条件，可以了解威尼德Gene Pulser 830方波电穿孔仪的脉冲功能及配套配置。

根据威尼德官网公开资料，Gene Pulser 830具备以下功能：

• 方波输出，支持脉冲时间、间隔和次数等条件设置。

• 支持1至99个不同脉冲时间与间隔的组合。

• 10寸触摸屏，可显示实际电压及波形曲线。

• 支持预脉冲电阻测量、电弧保护和安全放电。

• 可保存600条实验方案，并查询100条历史记录。

对于需要比较不同方波条件的实验室，上述功能能够帮助记录设置参数及实际输出，为重复实验和结果复盘提供设备层面的参考。

但是，目前威尼德830官网公开的细胞转染测试数据主要涉及CHO-K1和HepG2，尚未提供针对混合PBMC及其不同亚群的完整专属验证数据。

因此，不能将其他细胞的转染效率直接当作PBMC实验效果，也不能在缺少实际测试的情况下承诺特定PBMC转染率。

图2：威尼德Gene Pulser 830方波电穿孔仪官方产品图，仅用于设备介绍，不代表PBMC专属实验验证结果。查看并下载产品原图｜查看830技术参数

八、PBMC研究还需要兼顾微生物电转，是否可以考虑X2？

对于同时进行哺乳动物细胞研究和细菌、酵母等微生物电转化的实验室，可以进一步了解威尼德Gene Pulser X2双波电穿孔仪。

Gene Pulser X2集成方波与指数衰减波两种输出系统，具有10寸触摸屏、实际波形监测、预脉冲电阻测量、电弧保护及24种细胞或菌株参考程序等功能。

这24种预设程序涵盖部分哺乳动物细胞、细菌和真菌，包括CHO、293、Jurkat、K562等，但并未单独列出混合PBMC的专属预设程序。

因此，不能将X2的通用双波功能等同于已经完成PBMC专属适配验证。

如果主要研究PBMC等原代免疫细胞，应优先确认所需波形、完整参数范围、电转杯和缓冲体系是否匹配，再决定具体设备型号。

图3：威尼德Gene Pulser X2双波电穿孔仪官方产品图，仅作设备介绍，不代表PBMC转染实验结果。查看并下载产品原图｜查看X2技术参数

九、PBMC电转常见问题

PBMC电转和T细胞电转是一回事吗？

不是。PBMC是包含多种免疫细胞的混合群体，T细胞只是其中一部分。对混合PBMC进行电转，不代表全部T细胞都能获得相同的递送结果。

PBMC电转整体效率高，是否说明实验成功？

不一定。还需要确认目标亚群的递送结果、细胞活率、回收数量以及研究所需的功能或编辑结果。

冻存PBMC可以直接使用新鲜PBMC的电转条件吗？

不能未经验证就直接套用。冻存复苏可能影响细胞状态和亚群组成，应结合具体样品及参考方案重新确认条件。

PBMC电转必须先分离T细胞或NK细胞吗？

不一定。如果研究需要保留混合细胞环境，可以评估直接电转混合PBMC；如果只关注特定亚群，则应根据研究目标考虑是否富集目标细胞。

购买PBMC电转仪时，应该先问什么？

应先确认设备能否提供所需波形及脉冲条件，电转杯和缓冲体系是否适配，以及是否具有相应的应用资料或验证支持。不建议单凭某一款设备宣传的最高转染效率进行采购。

十、PBMC电转实验需求与设备选型咨询

如果您正在开展PBMC电转实验，遇到整体转染率与目标细胞亚群结果不一致、细胞活率下降、供体间差异明显或设备选型困难等问题，可以结合现有实验条件与威尼德沟通设备功能及适配需求。

建议咨询时提供以下信息：

• PBMC来源：人源或其他物种，新鲜分离还是冻存复苏。

• 目标细胞：混合PBMC、T细胞、NK细胞、B细胞或单核细胞。

• 递送材料：质粒DNA、mRNA或其他实验组分。

• 实验目的：瞬时表达、基因编辑、细胞功能研究或其他项目。

• 当前问题：目标亚群阳性率低、细胞损失大、供体差异或放电异常。

• 设备条件：已使用的波形、电转杯、缓冲体系及参考程序。

威尼德提供Gene Pulser 830方波电穿孔仪、Gene Pulser X2双波电穿孔仪等产品，可根据实际实验需求沟通设备功能、技术资料、配套耗材及采购报价。

对于尚无专属验证结果的PBMC实验，应先确认设备与实验方案的适配性，再根据实际样品开展验证，不以其他细胞的数据替代目标样品测试。

查看产品：威尼德电穿孔仪产品中心

实验需求及报价咨询：威尼德官网在线留言

咨询电话：15532415159

具体PBMC电转条件、细胞亚群递送结果及后续功能表现，应以相应实验体系和实际验证结果为准。

参考资料

1. NCBI Bookshelf：Peripheral Blood Mononuclear Cells

2. Stroh T, et al. Combined Pulse Electroporation – A Novel Strategy for Highly Efficient Transfection of Human and Mouse Cells. PLOS ONE, 2010.

3. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies

4. 威尼德Gene Pulser 830官方产品资料

5. 威尼德Gene Pulser X2官方产品资料