电转仪操作步骤：方波多脉冲程序怎么设置与核对？

电转仪怎么用？对于第一次开展细菌电转化或哺乳动物细胞转染的实验室，按照说明书完成装样、设置参数和放电，只代表完成了设备操作，并不代表已经证明整个实验流程有效。

例如，一次大肠杆菌电转后没有获得菌落，究竟是仪器没有正常放电、感受态细胞状态不好，还是质粒和筛选培养基不匹配？又如，HEK293细胞完成电脉冲后没有出现GFP信号，是设备问题，还是表达载体或检测条件存在问题？

这些情况如果没有设置适当的对照组，就容易把所有失败原因都归到电转仪上。

本文重点介绍电转仪首次使用时如何设计阳性对照、阴性对照和必要的细胞状态对照，分别适用于常见细菌质粒电转化及哺乳动物细胞质粒转染研究。通过对照结果，帮助实验人员判断下一步应该检查设备、样品还是实验检测过程。

一、电转仪怎么用？第一次实验先明确成功标准

常规电转操作可以概括为准备样品、选择程序、安装电转杯、施加电脉冲、恢复培养和检测结果。

但对第一次使用设备的实验室而言，还有一个不能忽略的问题：准备通过什么结果确认本次实验有效？

对于细菌电转化，可以观察是否获得符合筛选条件的菌落，再根据DNA投入量、铺板比例等信息计算转化效率。

对于哺乳动物细胞质粒电转染，则可以通过合适的报告基因检测表达情况，同时记录活细胞比例和回收数量。

这些检测方式针对不同实验目的，不能互相替代。

第一次使用电转仪：从操作到结果确认

确定样品及已有实验方案

确认细胞、质粒、波形和耗材

↓

设置必要的阳性、阴性对照

明确哪些结果代表实验体系有效

↓

按适用说明执行电脉冲

核对实际输出及异常信息

↓

恢复培养与结果检测

分别统计菌落或细胞表达与存活

↓

结合对照判断是否需要排查

明确设备、样品和检测各自的可能问题

图1：电转仪首次实验的完整判断流程示意，不代表某型号设备的自动检测流程。

需要注意，生物学阳性对照成功，只能说明相应实验流程具备产生有效结果的能力，不能直接代替厂家规定的设备电学性能检测或校准。

二、第一次做细菌电转，为什么需要pUC19阳性对照？

在大肠杆菌电转化研究中，pUC19是一种经常用于评价感受态细胞转化效率的标准质粒。

New England Biolabs（NEB）公开的电转协议中，明确采用规定浓度的pUC19作为阳性转化对照。

其作用是帮助实验人员在相对明确的DNA与感受态条件下，判断整套电转化流程是否能够产生预期的转化子。

1. 建议区分三个实验组

如果需要进一步评价感受态细胞能否正常存活，还可以根据实验设计设置非选择性培养相关对照。

需要注意，标准质粒的抗性标记必须与选择培养条件对应。pUC19具有氨苄青霉素抗性标记，不应在不匹配的选择培养条件下使用后，再把没有菌落归因于电转仪。

2. 阳性对照成功，说明什么？

如果标准质粒能够产生符合预期的转化子，说明该次实验所使用的感受态细胞、标准DNA、电脉冲及恢复筛选流程至少能够支持这一对照反应。

如果待测质粒仍然没有获得预期菌落，应进一步检查待测质粒的质量、大小、抗性标记、DNA溶液组成及宿主适配性。

但不能因此直接推断电转仪在所有负载、波形或电压条件下均处于正常状态。

3. 阳性对照失败，是否说明仪器坏了？

不一定。

阳性对照也可能受到感受态批次、标准质粒保存状态、缓冲液、耗材、电脉冲条件及恢复培养过程影响。

因此，建议先核对实验所使用的具体菌株和感受态产品说明，再检查设备实际输出记录。

图2：大肠杆菌AB1157在琼脂培养基上形成的菌落。来源：Kelseymflanagan / Wikimedia Commons，CC BY 3.0，原图未修改。该照片并非电转阳性对照实验数据，仅用于展示菌落形态。查看图片原文件。

三、为什么建议把标准质粒和实验质粒分开检测？

标准质粒与实验质粒的作用不同。

标准质粒主要帮助研究人员建立参照条件，而实验质粒可能具有更大的分子量、更复杂的结构或不同的DNA纯化状态。

NEB官方电转技术资料指出，连接反应混合物中的盐分和其他成分可能显著降低电转化效率；其与纯化的标准pUC19对照之间可以出现明显差异。

例如，一次实验中标准pUC19对照获得了符合要求的转化子，但大型载体实验组没有得到预期克隆，可能需要进一步检查目标质粒或连接反应体系。

这时直接提高电压并不一定能够解决问题，还可能增加异常放电的风险。

对于刚开始使用新设备的实验室，建议优先固定一套适合当前感受态细胞的参考方法，再单独评价目标构建。

四、第一次做哺乳动物细胞电转，应该怎样设置GFP对照？

如果实验室准备使用方波电转仪开展HEK293、CHO或其他哺乳动物细胞转染，可以考虑使用经过适当验证的GFP报告质粒作为表达阳性对照。

部分厂家提供专门的GFP对照质粒，例如Lonza的相关Nucleofector试剂盒包含pmaxGFP对照载体。

但某一品牌配套的专用质粒和电转液不应默认适用于所有其他设备。选择对照时，还应考虑目标细胞能否表达对应的报告基因。

1. 建议至少区分以下四种情况

如果实验主要研究DNA是否依赖电脉冲进入细胞，还可以根据需要增设“有DNA但不施加电脉冲”的相关对照。

需要特别注意，无DNA电转对照应按照当前设备和实验方案采用合适的处理条件，不能用完全空的电转杯代替正常负载进行高压测试。

2. 为什么不能只看GFP阳性率？

Thermo Fisher在其电转技术支持资料中，分别定义了细胞活率与转染效率，并介绍了通过GFP荧光检测评价表达阳性细胞的方法。

如果只记录GFP阳性率，而不记录活细胞数量，就可能忽略电脉冲对细胞的损伤。

例如，某组条件下有较高比例的存活细胞表达GFP，但实际回收的细胞数量明显减少，那么这套条件未必能够满足需要大量细胞进行后续培养的研究。

图3：HEK细胞GFP表达的荧光显微图。来源：TrJaagup / Wikimedia Commons，CC BY-SA 3.0，原图未修改。原始图片未证明采用电穿孔方法，仅用于展示GFP表达这一检测终点。查看图片原文件。

五、对照组应该怎样帮助判断电转失败原因？

当对照实验完成以后，建议将设备记录、阳性对照和待测样品结果一起分析。

这些结果只能帮助缩小排查范围，不能单独确定故障原因。

例如，GFP阳性对照正常，说明这套体系能够实现报告质粒表达，但并不保证所有不同大小或组成的核酸材料都能够得到相同的递送效果。

六、第一次使用电转仪，为什么不建议直接拿珍贵样品试机？

对于原代免疫细胞、干细胞及其他珍贵样品，如果实验室尚未确认设备操作与适用参数，直接使用大量目标样品可能增加实验成本。

如果研究条件允许，可以考虑先采用经过验证的常规细胞系、标准DNA或合适的参考体系熟悉设备操作，再根据实际项目要求开展目标样品实验。

需要明确，常规细胞系对照成功并不意味着目标原代细胞一定能够获得相同结果。

例如，HEK293细胞GFP表达正常，只能说明对应电转方法适用于该测试条件，不能据此推断T细胞、NK细胞或干细胞必然适用同一程序。

如果需要针对珍贵样品建立首次电转方案，建议提前与设备厂家确认波形、参数范围、耗材和必要的验证方法。

七、细菌电转和细胞电转的阳性对照，为什么不能共用？

细菌电转化与哺乳动物细胞转染的评价体系不同。

大肠杆菌质粒电转化通常通过合适的选择培养和菌落形成结果进行判断；哺乳动物细胞GFP质粒转染则通常通过荧光表达、活率及后续细胞功能进行评价。

因此，细菌标准质粒在大肠杆菌中获得高转化效率，不代表该质粒能够在哺乳动物细胞中正常表达。

反过来，一份用于哺乳动物细胞表达的GFP质粒，如果缺少与当前细菌宿主适配的复制和选择元件，也不能直接作为细菌电转化质量对照。

如果实验室同时开展两类电转项目，应分别建立适合对应宿主与研究目标的阳性对照，而不是用一份质粒证明全部实验都正常。

八、怎样把首次电转结果整理成可复用的参考记录？

当第一次实验获得符合要求的对照结果后，建议把关键条件保存下来，作为后续同类实验的参考。

可以记录：

• 实验日期、操作人员和样品编号；

• 细胞或菌株来源、批次和状态；

• 阳性对照和待测质粒名称；

• 电转仪型号、波形及对应程序；

• 电转杯间距、样品体积与缓冲液；

• 设备设定参数及实际输出记录；

• 是否出现异常提示或中断；

• 恢复培养与检测时间；

• 阳性、阴性对照结果；

• 菌落数量、GFP阳性率或活细胞回收结果。

对于不同实验室条件，还应根据当前研究需求补充必要的数据。

记录的价值在于：下一次使用相同体系时，如果结果发生变化，可以先比较样品和设备条件，而不是从零开始猜测原因。

九、首次使用微生物电转仪，Gene Pulser 630能提供什么帮助？

对于大肠杆菌、酵母等微生物指数衰减波电转研究，除了选择合适的标准质粒和感受态，还需要确认设备是否能够完成相应脉冲条件。

威尼德Gene Pulser 630为指数衰减波电穿孔仪。根据官网资料，该设备支持电压、电容、电阻及时间常数相关设置，并可以显示实际电压、时间常数及波形。

同时，设备提供预脉冲电阻检测和异常放电保护等功能，可以辅助实验人员核对部分电学条件。

图4：威尼德Gene Pulser 630指数衰减波电转仪。查看产品原图。

如果实验室已经确定使用某种商业电感受态细胞，可以提供厂家说明书中的完整脉冲要求，由威尼德技术人员确认Gene Pulser 630的对应设置范围及电转杯兼容性。

但需要强调：设备具备实际波形显示，并不代表它能够直接检测菌落数量或自动计算每份DNA的生物学转化效率。

十、首次使用方波电转仪，Gene Pulser 830适合什么研究？

如果实验室首次开展HEK293、CHO、Jurkat或其他哺乳动物细胞转染，可以先根据已有研究及细胞体系选择适当的报告基因对照，再核对目标设备的方波输出能力。

威尼德Gene Pulser 830主要面向真核细胞方波电转研究。

根据官网公开资料，其支持设置脉冲强度、时间、次数和间隔，能够显示实际波形，并提供预脉冲电阻测量、实验方案保存及历史记录功能。

对于使用GFP报告质粒建立实验条件的客户，可以将脉冲记录、GFP阳性率及细胞活率进行对应，逐步确认当前实验体系是否稳定。

图5：威尼德Gene Pulser 830方波电转仪。查看产品原图。

产品技术说明：Gene Pulser 630和Gene Pulser 830的脉冲记录、电阻检测及保护功能来自各型号公开产品资料，不代表设备具备自动判断细胞转染成功的能力。实验结果仍需要通过培养、计数、荧光或其他适合的方法进行检测。

十一、电转仪首次使用常见问题

1. 第一次使用电转仪，一定要设置阳性对照吗？

对于需要建立实验体系或判断失败原因的项目，设置适当阳性对照通常很有价值。具体对照应根据细胞、菌株和研究目标设计。

2. pUC19阳性对照有菌落，是否证明仪器完全正常？

不能。它说明该次标准质粒电转化体系可以产生转化子，但无法代替设备的完整电学性能测试，也不能证明其他样品条件一定成功。

3. 无DNA阴性对照出现菌落，一定是电转仪坏了吗？

不一定。应核对菌株抗性、培养基选择条件、污染和样品混淆等因素。

4. GFP阳性对照表达正常，为什么目标质粒没有表达？

可能与目标载体设计、启动子、质粒质量、细胞内递送及检测方式有关，应结合具体实验条件判断。

5. 无DNA电转对照细胞死亡很多，应该立即降低电压吗？

不应只调整一个数字就认定问题解决。还需要核对缓冲液、细胞状态、脉冲时间、次数及电转后恢复条件，再设计合理的验证方案。

6. 首次使用电转仪，可以用空电转杯放电测试吗？

不应将空杯或空载放电作为通用测试方法。应遵循厂家说明书，必要时使用其规定的测试负载或由专业人员进行检测。

7. 两台不同品牌电转仪，使用同一阳性对照就能直接比较性能吗？

不能简单判断。还需要确认波形、电转杯、实际输出及样品条件是否具有可比性，必要时采用统一且适当的验证方案。

十二、第一次用电转仪没有成功，怎样向厂家咨询？

对于第一次开展电转实验的客户，如果已经按照现有说明完成操作，但阳性对照或待测样品没有取得预期结果，可以将以下信息整理后提供给技术人员：

• 实验对象：具体细胞系、菌株或其他样品；

• 递送材料：质粒DNA、mRNA、Cas9 RNP等；

• 设备信息：现有电转仪型号、波形及电转杯规格；

• 脉冲条件：电压、脉宽、次数、间隔或指数波相关参数；

• 阳性对照：对照材料、检测结果及对应实验条件；

• 阴性对照：是否存在异常菌落或背景荧光；

• 实际实验结果：菌落数量、表达阳性率或细胞活率；

• 咨询需求：使用培训、样品适配、设备检测或采购报价。

例如，可以直接向威尼德技术人员说明：

“我们实验室第一次使用电转仪开展大肠杆菌质粒电转化，标准pUC19阳性对照获得了菌落，但目标质粒没有成功转化。希望先核对现有电脉冲条件、感受态及电转杯是否匹配，并了解Gene Pulser 630的相关功能与配置。”

如果是哺乳动物细胞，可以说明：

“我们使用HEK293细胞进行GFP质粒方波电转，准备通过GFP表达和细胞活率建立首次实验对照，希望确认Gene Pulser 830是否支持相应的脉冲条件，并咨询设备操作培训及技术支持。”

通过这些信息，可以让技术人员先判断需要检查哪一个环节，而不是仅凭“电转失败”四个字推荐更高电压或新设备。

如果还需要了解基础操作，可阅读官网已有的《电穿孔仪怎么用？细胞转染与微生物电转操作流程》；如果需要计算菌落转化效率和GFP阳性率，可参考官网相关技术支持文章。

威尼德生物科技（北京）有限公司可根据客户提供的细胞或菌株、已有电转方法及实际检测结果，协助沟通电穿孔仪功能适配、操作培训和设备采购需求。

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威尼德生物科技（北京）有限公司
技术咨询电话：15532415159

参考资料及图片来源

1. New England Biolabs. Electroporation Protocol (C2989). pUC19阳性对照及标准电转化方法。

2. New England Biolabs. Electroporation Tips. 感受态、DNA质量、恢复培养与电弧相关参考。

3. Thermo Fisher Scientific. Electroporation Support—Getting Started. 细胞活率与GFP阳性率检测方法。

4. Lonza. Amaxa Cell Line Nucleofector Kit T. GFP表达阳性对照在特定细胞电转平台中的使用案例。

5. Kelseymflanagan. E. coli plate.JPG. Wikimedia Commons，CC BY 3.0。

6. TrJaagup. HEK cell transfection.jpg. Wikimedia Commons，CC BY-SA 3.0。

7. 威尼德Gene Pulser 630指数衰减波电穿孔仪产品资料及图片。

8. 威尼德Gene Pulser 830方波电穿孔仪产品资料及图片。

科研与安全说明：本文提供的是首次电转实验的对照设计和结果判断思路，不构成适用于所有细胞、菌株和递送材料的固定实验程序。pUC19及GFP对照应根据宿主和具体设备选择，并遵循对应试剂和设备的使用说明。生物学对照结果不能代替设备专业电学检测；不同厂家专用试剂、程序和耗材不应未经确认直接互换。出现异常放电或高压故障时，应停止不安全操作并联系专业技术人员。