干细胞CRISPR/Cas9 RNP电转参数如何优化？

干细胞CRISPR/Cas9 RNP电转参数应该如何设置？Cas9蛋白与gRNA需要怎样组装？为什么有些实验电转后的细胞存活率较高，但目标基因编辑效率却很低？

对于正在开展诱导多能干细胞（iPSC）、造血干/祖细胞（HSPC）及其他干细胞CRISPR基因编辑的科研人员来说，RNP电转是值得关注的非病毒递送方式。但电转是否成功，不仅取决于电压、脉冲宽度和次数，还涉及Cas9蛋白活性、gRNA质量、RNP组装、缓冲液以及电转后的细胞恢复。

本文结合公开的多能干细胞RNP电转协议，介绍1200V、20ms与30ms等参考条件，分析影响RNP递送和编辑效率的关键因素，并提供针对不同实验结果的优化思路。

一、为什么干细胞CRISPR基因编辑常使用RNP电转？

CRISPR/Cas9系统主要依靠Cas9核酸酶和向导RNA（gRNA）识别目标DNA序列，并在特定位点完成切割，再通过细胞自身的DNA修复过程产生基因编辑结果。

传统方法可以将编码Cas9和gRNA的质粒DNA递送进入细胞，由细胞表达对应组分。RNP方法则是在电转前将Cas9蛋白和gRNA组装为核糖核蛋白复合物，再通过电穿孔将其直接递送进入细胞。

1. RNP递送与质粒DNA递送有什么区别？

RNP在细胞内的作用时间通常较短，有助于减少Cas9长期持续表达带来的部分风险，但并不意味着一定没有脱靶编辑。

对于需要建立稳定基因编辑细胞模型的实验，仍应根据研究目的开展目标位点鉴定及必要的脱靶评估。

2. Cas9 RNP如何识别目标DNA？

gRNA负责引导Cas9识别目标DNA序列。对于常用的SpCas9系统，目标附近还需要存在相应PAM序列。Cas9识别目标后进行切割，随后细胞通过非同源末端连接（NHEJ）或其他DNA修复途径完成修复。

图1：Cas9、sgRNA及目标DNA三元复合物结构示意图。图源：Gerardduenas / Wikimedia Commons，CC BY-SA 4.0，原图未修改。

二、干细胞RNP电转参数有哪些公开参考条件？

实验人员查找CRISPR RNP电转参数时，通常希望得到具体电压、脉冲宽度和次数。但是，不同设备的电极结构、缓冲体系与电脉冲输出方式并不完全相同，因此不能脱离具体实验体系使用这些数值。

1. iPSC使用Neon系统的RNP参考参数

Thermo Fisher Scientific在《CRISPR-Cas9 Genome Editing for Research of Human Pluripotent Stem Cells Cultured in StemFlex Medium via Electroporation》技术协议中，提供了人多能干细胞Cas9-gRNA复合物电转条件。

该方案针对StemFlex培养体系下的人多能干细胞，使用Neon电转设备和配套耗材，递送Cas9-gRNA复合物。

1200V不是所有干细胞RNP电转的推荐电压。上述参数属于Neon专用体系，不能直接复制到其他品牌的普通方波电穿孔仪。

2. 为什么20ms和30ms不能只比较数字大小？

程序7采用30ms单脉冲，而程序14采用20ms双脉冲。虽然两者电压相同，但脉冲持续时间与次数不同，实际作用于细胞的电刺激过程也存在区别。

不能简单认为30ms一定比20ms具有更高的编辑效率，也不能直接认为双脉冲一定比单脉冲更适合干细胞。

实验人员需要同时评价编辑效率、细胞存活率、有效细胞回收数量和后续恢复结果。

三、Cas9蛋白和gRNA应该怎样组装RNP？

RNP电转与普通质粒转染的重要区别之一，是递送前需要先形成Cas9-gRNA复合物。

如果Cas9蛋白活性不足、gRNA质量存在问题，或者复合物组装过程不稳定，即使电脉冲能够实现有效递送，最终编辑效率仍可能偏低。

1. 公开协议中的RNP组装参考条件

在前述Thermo Fisher Scientific多能干细胞协议中，Cas9与gRNA采用以下组装条件：

该条件对应指定Cas9产品、gRNA及Neon实验体系。不同Cas9蛋白规格、gRNA类型和细胞数量可能需要调整组装条件，不能直接将其视为所有RNP实验的通用配方。

2. RNP组装需要重点检查什么？

当编辑效率较低时，可以先检查：

• Cas9蛋白是否符合实验使用要求；

• gRNA序列与目标位点是否匹配；

• gRNA是否存在降解或质量问题；

• Cas9与gRNA加入量是否与所用协议一致；

• 组装时间、缓冲体系及保存条件是否符合要求；

• 是否使用经过验证的阳性对照gRNA。

如果已经使用正确的电脉冲程序，但阳性对照能够正常编辑、目标gRNA却无法获得预期结果，那么应优先检查目标序列和gRNA活性，而不是立即增加电压。

四、为什么RNP进入干细胞后，编辑效率仍可能很低？

电转递送与基因编辑是两个相关但不完全相同的过程。即使RNP能够进入细胞，也不代表一定能够在目标位点产生较高比例的预期编辑。

1. gRNA靶点及活性可能限制编辑效率

gRNA设计、目标序列、PAM位置和染色质状态都可能影响Cas9识别与切割。

如果采用同一批细胞和同一套电脉冲，不同gRNA仍然表现出明显不同的编辑结果，说明问题可能更多来自编辑体系本身。

可以使用已验证的阳性对照gRNA，帮助区分电转递送问题与目标位点编辑问题。

2. 基因敲除与精准敲入的评价不同

对于基因敲除（KO），研究通常通过目标位点的插入或缺失突变（indel）评价编辑结果。

如果研究目标是单碱基替换或精准敲入（KI），则可能需要额外引入供体DNA，并考虑目标位点、供体模板和DNA修复途径。

因此，即使RNP切割效率较高，也不代表HDR介导的精准敲入效率一定很高。

2021年STAR Protocols发表的多能干细胞RNP电转方案，专门针对Cas9-gRNA复合物及单链供体DNA递送进行了优化，说明精准编辑需要综合考虑RNP递送与供体模板条件。

3. 细胞恢复能力会影响有效编辑细胞数量

如果某组参数产生较高的编辑比例，但细胞存活数量明显减少，最终能够用于后续克隆筛选或分化研究的编辑细胞数量可能不足。

因此，建议将编辑率和活细胞回收数量作为两个独立指标记录，而不是只比较一个百分比。

图2：人胚胎干细胞集落相差显微图，展示SA02细胞系培养形态。本图用于说明多能干细胞培养观察对象，并非RNP电转后的实验结果。图源：Id711 / Wikimedia Commons，公共领域。

五、干细胞RNP电转参数应该按照什么顺序优化？

如果实验人员已经找到与细胞类型匹配的参考方案，下一步应当通过合理的实验设计区分递送、编辑和细胞恢复三个环节。

第一步：确认细胞类型及完整实验体系

首先确定实验使用的是iPSC、CD34+造血干/祖细胞、MSC还是其他细胞。

同时明确递送材料、细胞数量、样品体积、缓冲液、电转设备、电极结构以及后续培养条件。

不建议将iPSC的Neon程序直接应用于CD34+或MSC，也不建议将不同品牌电转系统的程序代码视为可以直接互换的参数。

第二步：分别评价电脉冲和RNP体系

在细胞培养条件保持一致的情况下，可以按照经过验证的方法设置未电转对照、仅电转操作对照，以及使用验证过的gRNA的编辑阳性对照。

通过对照结果，判断细胞死亡是否主要发生在电转操作后，或者编辑效率不足是否来自RNP体系。

在确认样品与递送材料没有明显问题后，再根据设备输出范围和既有研究资料进行有限的脉冲条件比较。

第三步：同时比较编辑效率和细胞活率

建议根据实验要求记录以下指标：

• 电转前细胞数量及活率；

• 电转后实际回收活细胞数量；

• 目标位点编辑比例；

• 不同检测时间点的细胞恢复情况；

• 需要时评估单克隆形成与扩增；

• 必要的多能性、分化或其他功能指标。

第四步：使用独立细胞批次验证

确定初步可行条件后，还应通过独立细胞批次验证重复性。

对于需要建立稳定基因编辑细胞模型的课题，应在后续培养中检查基因型、克隆稳定性及研究所要求的细胞功能。

干细胞CRISPR RNP电转优化流程

第一阶段：RNP与细胞准备

细胞状态 + Cas9蛋白 + gRNA质量 + 复合物组装

↓

第二阶段：电转参数筛选

电压 + 脉冲宽度 + 次数 + 缓冲液及电极适配

↓

第三阶段：编辑效率与活率评价

目标位点编辑 + 活细胞回收 + 细胞恢复

↓

第四阶段：重复性与后续功能验证

独立批次 + 基因型鉴定 + 克隆及功能评价

图3：Cas9 RNP组装、电转参数优化及基因编辑结果评价流程

六、RNP电转失败应该如何判断问题原因？

需要注意，同一种异常现象可能由多个因素造成。建议通过对照实验逐项排查，不要因为一次结果不理想就同时更换缓冲液、增加RNP用量和提高电压。

七、开展干细胞RNP电转应该怎样选择电穿孔仪？

在选择用于CRISPR/Cas9 RNP递送的电穿孔仪时，实验室首先需要确认细胞类型、样品量和目标电转条件。

对于需要反复开发真核细胞方波电转参数的实验室，可以重点评估脉冲控制、实际波形显示、样品电阻检测及实验程序保存能力。

威尼德Gene Pulser 830方波电穿孔仪

威尼德V-leader Gene Pulser 830是一款面向哺乳动物细胞及其他真核细胞电转应用的方波电穿孔仪，可以作为干细胞RNP递送实验的设备选型参考。

根据产品公开资料，该设备具备以下功能：

• 方波脉冲输出；

• 支持1—99个脉冲组合；

• 支持不同脉冲时间与间隔设置；

• 显示实际电压、脉冲时间及波形；

• 支持预脉冲样品电阻测量；

• 具备电弧保护与异常安全放电功能；

• 支持600条实验方案保存及100条历史记录查询。

对于需要进行不同RNP电转条件比较的实验室，这些功能有助于保存实验设置、记录实际输出和排查重复性问题。

但设备具有方波输出及参数调节能力，不代表已经针对所有干细胞类型验证Cas9 RNP递送效果。

尤其是文献中的Neon 1200V程序及其他品牌专用电转程序，不能直接视为Gene Pulser 830的可复现参数。正式选型前应向厂家确认电压、脉宽、耗材兼容性及实际样品验证条件。

图4：威尼德Gene Pulser 830方波电穿孔仪正面展示，点击查看产品详情。

图5：Gene Pulser 830侧前方产品图，用于了解设备外观及操作界面。

八、干细胞CRISPR RNP电转常见问题

1. Cas9 RNP电转必须使用1200V吗？

不是。1200V来自指定Neon多能干细胞实验协议，不适用于所有设备和细胞。不同电极结构及缓冲液体系需要单独验证。

2. RNP组装好以后为什么编辑率仍然低？

可能涉及gRNA活性、Cas9蛋白质量、目标序列、RNP递送条件或编辑检测方法。应优先通过阳性对照判断问题，而不是直接增加电压。

3. Cas9 RNP浓度越高，编辑效率越好吗？

不一定。增加RNP用量可能改善部分实验条件下的编辑结果，但也可能改变样品体系或细胞耐受情况，应依据具体产品和细胞实验方案验证。

4. RNP电转成功后还需要检测脱靶吗？

RNP递送可以缩短Cas9在细胞内的作用时间，但不能完全排除脱靶编辑。对于需要建立稳定细胞模型的实验，应根据课题要求开展必要的编辑位点和脱靶评估。

5. 同一套RNP参数可以用于iPSC和CD34+细胞吗？

不能默认通用。不同干细胞来源、培养状态和电转体系存在差异，需要分别确认适用条件。

九、干细胞RNP电转技术咨询需要提供哪些信息？

如果实验室正在开展CRISPR/Cas9 RNP基因编辑，或者需要评估电穿孔仪能否满足现有实验需求，建议提前准备：

• 细胞类型：iPSC、MSC、CD34+或其他干细胞；

• 细胞来源、培养体系和当前活率；

• Cas9蛋白型号及gRNA类型；

• 是否加入ssODN或其他供体DNA；

• 实验目标：基因敲除、精准敲入或其他编辑；

• 现有电转设备、缓冲液、电极和脉冲条件；

• 当前编辑效率、活细胞回收及克隆恢复结果。

例如，客户可以说明：“目前使用人iPSC进行Cas9 RNP基因敲除，电转后细胞活率正常，但目标位点编辑率偏低，希望排查RNP递送条件，并评估方波电穿孔仪的适配能力。”

相比直接询问“RNP电转需要多少伏”，提供具体细胞与实验信息，更有助于判断真正需要解决的问题。

如果正在开展造血干/祖细胞基因编辑，可阅读《CD34+细胞电转仪怎么选？基因编辑重点看什么？》。

如果需要了解原代细胞的参数开发思路，可参考《原代细胞、免疫细胞电转参数优化》。

威尼德V-leader可根据客户的细胞类型、递送材料、实验目的及现有条件，协助沟通电穿孔设备的参数控制能力和实验适配验证需求。

咨询RNP电转设备电话咨询技术人员

威尼德生物科技（北京）有限公司
技术咨询电话：15532415159

参考资料与图片来源

1. Thermo Fisher Scientific. CRISPR-Cas9 Genome Editing for Research of Human Pluripotent Stem Cells Cultured in StemFlex Medium via Electroporation. MAN0016956.

2. Optimized electroporation of CRISPR-Cas9/gRNA ribonucleoprotein complex for selection-free homologous recombination in human pluripotent stem cells. STAR Protocols. 2021;2:100965.

3. Comprehensive protocols for CRISPR/Cas9-based gene editing in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 2016.

4. Gerardduenas. Cas9-sgRNA-DNA Ternary Complex. Wikimedia Commons，CC BY-SA 4.0。

5. Human embryonic stem cell colony phase. Wikimedia Commons，公共领域。

技术说明：本文所列RNP组装条件、1200V电压及脉冲时间来自第三方公开协议，不代表威尼德设备已经验证相同参数。RNP电转的实际效果需要结合细胞类型、编辑体系、仪器和耗材进行独立验证。本文内容用于科研技术交流。