mRNA转染效率低怎么办？先排查这6个关键环节

更新时间：2026-09-11 点击次数：6

做过mRNA转染实验的人，可能都遇到过类似情况：

同样的mRNA、同一种细胞，看起来实验步骤也没有明显变化，第一次表达很好，下一次转染效率却突然下降。

遇到这种情况以后，很多人的第一反应是：

“是不是mRNA坏了？”

mRNA质量当然非常重要，但对于体外或离体细胞mRNA递送来说，最终表达结果通常并不是由单一因素决定。

细胞状态、mRNA质量和加入量、电转缓冲体系、电脉冲、电转后的恢复以及最终检测时间，都可能改变实验结果。

因此，mRNA转染效率低时，与其一次把所有条件全部修改，不如先判断：

到底是哪一个环节出了问题。

一、第一步：先确认你说的“mRNA转染效率低”到底是哪种低

这是排查mRNA实验时非常重要、但经常被忽略的一步。

所谓“效率低”，实际上可能对应至少三种完全不同的结果：

实验现象	可能优先排查的方向
阳性细胞比例很低	mRNA质量、递送条件、电脉冲、细胞状态
阳性细胞不少，但单细胞表达强度低	mRNA剂量、mRNA结构与翻译能力、检测时间
阳性率不错，但最终活细胞数量很少	细胞损伤、电转强度、恢复培养和mRNA剂量

如果使用流式细胞术评价mRNA表达，还应该注意：

阳性细胞百分比和MFI等表达强度指标不是同一件事。

例如一组条件可能已经让大部分细胞成为阳性，但继续增加mRNA以后，变化主要体现在单细胞表达强度，而不是阳性比例继续线性升高。

所以真正开始排查以前，先把“哪里低”定义清楚，往往能少走很多弯路。

二、关键环节1：先确认mRNA质量，而不只是看浓度

mRNA本身容易受到RNase影响。

如果保存、分装、冻融或者实验操作过程中发生明显降解，那么即使后面的递送条件完全正常，也可能导致蛋白表达下降。

因此，mRNA转染结果异常以后，可以先检查：

不同实验是否使用同一批mRNA；
保存条件是否一致；
是否发生了多次冻融；
工作区域和耗材是否按照RNA实验要求控制RNase污染；
mRNA实际浓度是否准确；
必要时是否检查RNA完整性。

如果使用的是自行制备的体外转录mRNA（IVT mRNA），需要关注的还不止“有没有降解”。

5'端帽结构、UTR、poly(A)尾以及制备和纯化质量，都可能影响mRNA在细胞中的稳定性和翻译表现。

另外，IVT过程产生的杂质也可能改变细胞对mRNA的反应。

因此：

两管浓度完全相同的mRNA，并不能仅凭浓度就判断它们具有完全相同的转染和表达能力。

三、为什么“蛋白表达低”不能直接等同于“mRNA没有进去”？

mRNA通过递送过程进入细胞质以后，还需要被细胞翻译系统识别，并最终产生目标蛋白。

也就是说，实验人员最终通过GFP或者目标蛋白看到的信号，其实处在整个过程的后端。

mRNA进入细胞质以后还需要通过核糖体完成蛋白翻译，因此最终蛋白表达信号同时受到mRNA递送、稳定性、翻译和检测时间影响

图片来源：LadyofHats / Wikimedia Commons，Public Domain

所以如果最终荧光或者目标蛋白信号偏低，可能来自：

真正进入细胞的mRNA数量不足；
mRNA已经部分降解；
mRNA结构或制备质量影响翻译；
检测时间与表达窗口不匹配。

因此，“mRNA递送效率”和“最终蛋白表达结果”虽然相关，但不应该在所有情况下被完全当成同一个指标。

四、关键环节2：细胞状态可能在电转以前就已经决定了一部分结果

如果mRNA质量没有明显异常，下一步应该检查细胞。

很多mRNA转染问题实际上在电脉冲发生以前就已经埋下了。

例如：

细胞刚刚复苏，尚未恢复到稳定实验状态；
不同批次细胞培养时间不同；
细胞密度变化明显；
电转前基础活率下降；
原代细胞来自不同供体；
免疫细胞激活或扩增阶段发生变化。

这种情况下，即使设备程序完全不变，最终mRNA表达和细胞恢复也可能出现差异。

因此，长期开展mRNA电转的实验室最好同时建立一套电转前细胞状态标准。

不要只记录：

“某某细胞 + 某某电压。”

还应该记录细胞当时真正处于什么状态。

五、原代细胞和免疫细胞为什么尤其要重视这一点？

常规细胞系相对容易形成稳定的培养流程。

但对于原代细胞、T细胞、NK细胞、干细胞等样品，不同供体、不同扩增阶段以及不同实验批次都可能带来额外变化。

所以其他实验室的一组成功mRNA参数可以作为起点，却不能直接定义成自己的最佳条件。

如果正在复制论文或者其他实验室的电转程序，可以进一步查看复制电穿孔参数为什么失败？电转染与电转化条件差异解析。

六、关键环节3：mRNA是不是加得越多，表达就一定越高？

不建议这样理解。

在一些实验体系中，随着mRNA剂量增加，目标蛋白表达强度确实可能提高。

但这种关系并不意味着可以无限线性增加。

随着剂量继续提高，可能出现：

阳性细胞比例逐渐进入平台；
单细胞表达强度继续变化；
不同细胞对mRNA的耐受出现差异；
部分体系中细胞活率开始下降；
细胞自身对外源RNA的反应发生变化。

因此，第一次建立mRNA实验时，比直接采用很高的加入量更加合理的方法，是设计有限的mRNA剂量梯度。

每一个梯度同时记录：

阳性细胞比例；
表达强度；
细胞活率；
实际回收活细胞数。

这样才能判断增加mRNA以后真正改善了什么，又牺牲了什么。

七、关键环节4：采用mRNA电转时，不要只调整电压

如果使用电穿孔进行mRNA递送，电脉冲只是整个实验体系中的一部分。

对于方波电转，还需要同时考虑：

脉冲强度；
脉冲持续时间；
脉冲次数；
脉冲间隔；
电转杯电极间距；
缓冲体系；
细胞数量和体系体积；
mRNA加入量。

电场条件过弱时，可能无法建立足够的递送效果。

但单纯增强电脉冲，又可能增加细胞损伤。

因此真正需要寻找的是：

mRNA表达效率和细胞存活之间的工作窗口。

如果还不清楚方波和指数衰减波之间的区别，可以查看方波与指数衰减波电转仪有什么区别？电转化仪波形怎么选？。

八、相同的设置参数，为什么实验结果仍然可能变化？

因为实验人员在设备上输入相同数字，并不代表两次样品体系的所有条件都完全一致。

例如：

缓冲液组成或者批次发生变化；
细胞浓度存在差异；
mRNA原液带入体系的体积不同；
电转杯规格发生变化；
样品中存在气泡；
样品导电状态发生明显改变。

这些变量都应该纳入异常结果排查。

如果只是不断提高或者降低电压，很容易把真正的问题隐藏起来。

九、Gene Pulser 830在mRNA电转优化中能解决什么？

对于哺乳动物细胞、原代细胞、干细胞等真核细胞mRNA电转，可以进一步了解Gene Pulser 830方波电穿孔仪。

Gene Pulser 830采用高精度方波输出，可以分别设置脉冲强度和脉冲时间，并支持1～99个不同脉冲时间与间隔组合。

设备能够显示实际电压、脉冲时间、间隔、脉冲个数以及波形曲线，同时提供预脉冲样品电阻测量。

对于mRNA转染效率突然出现波动的实验，这些功能的主要价值不是“自动解决低效率”，而是帮助实验人员进一步判断：

实际电脉冲是否正常，以及设备端条件与历史成功实验有没有明显差异。

Gene Pulser 830方波电穿孔仪用于mRNA转染效率优化

Gene Pulser 830可用于真核细胞mRNA方波电转条件开发和实际脉冲记录，具体参数仍需结合细胞类型、mRNA和实验终点进行验证

需要特别注意：

设备能够帮助控制电脉冲，却不能解决mRNA已经降解、细胞状态异常或者检测时间选择错误等问题。

十、关键环节5：电转后的恢复流程不要成为新的变量

电脉冲完成以后，mRNA实验并没有结束。

对于部分敏感细胞，电转后的早期恢复阶段会直接影响最终可用细胞数量。

因此，不同批次实验应该尽量统一：

电脉冲结束后的处理流程；
恢复培养体系；
接种密度；
培养温度和环境；
后续换液和其他操作时间。

这里不建议脱离具体细胞，给所有实验规定一个统一的“恢复多少分钟”。

不同细胞、培养体系和实验方案可能需要不同的恢复流程。

真正应该做的是：

一旦自己的恢复条件验证有效，就把这一部分也纳入SOP。

十一、关键环节6：检测时间不对，也会制造“mRNA转染效率低”

mRNA的特点之一是能够在进入胞质后较快进入蛋白表达过程，但不同mRNA和目标蛋白的表达动力学并不完全一样。

所以不能简单规定：

“所有mRNA都在电转后某一个固定时间检测。”

如果检测过早，目标蛋白可能尚未积累到适合评价的水平。

如果检测过晚，随着mRNA逐渐降解以及蛋白自身周转，表达结果也可能已经开始变化。

因此，对于新建立的mRNA体系，建议根据项目设置几个合理的初始检测时间点。

然后分别观察：

阳性比例什么时候趋于稳定；
表达强度什么时候较适合评价；
细胞什么时候完成较好恢复；
什么时候更适合进入后续功能实验。

最后再把适合自己项目的检测时间固定下来。

十二、mRNA转染效率低，可以直接按照这张表排查

环节	主要检查内容	常见异常表现
mRNA质量	完整性、保存、冻融、浓度；IVT mRNA还需关注制备与纯化质量	整体表达偏低、不同批次差异明显
细胞状态	来源、培养阶段、活率、密度、原代细胞批次	效率和活率同时下降、批次漂移
mRNA剂量	每批加入量、浓度梯度和细胞数量	表达进入平台、活率变化或不同批次结果不一致
电转体系	缓冲液、电转杯、体积、电脉冲和样品状态	阳性率低、细胞损伤或异常放电
电转后恢复	培养液、接种密度、操作和恢复流程	初始表达尚可但后续细胞大量减少
检测	检测时间、阳性比例、MFI、活率和回收细胞数	实际递送正常却被误判为效率低