威尼德方波与指数波电穿孔仪：电转化实验过程中操作细节与注意事项

紫外交联仪   威尼德方波与指数波电穿孔仪：电转化实验过程中操作细节与注意事项

一、制备感受态的菌液收集时间：

1、准确测定OD值：OD在1.2～1.5之间。

1） 为了准确测定OD值，建议将菌液稀释不同浓度测定（1、2、4、8、16倍稀释，看其OD值是否呈线性关系）。每个倍数做3－5个重复，应该可以大致推断OD值是否准确！菌液看上去浑浊，但OD值不高，很可能OD稀释倍数不够！

2） OD值是否测准也可以这样估算：OD600为40左右时，菌体湿重（6000rpm离心5min）约0.95g/10ml。高密度发酵时菌体湿重将相应下降。

（MTT方法即比色法的吸收度在0.2～0.8之间误差较小。这和分析化学中的ｌａｍｂｅｒｔ-beer定律有关， 对朗伯-比尔定律的偏离在吸光光度分析中，经常出现标准曲线不呈直线的情况，特别是当吸光物质浓度较高时，明显地看到通过原点向浓度轴弯曲的现象（吸光度轴弯曲)。这种情况称为偏离朗伯-比尔定律。若在曲线弯曲部分进行定量，将会引起较大的误差。在吸光光度分析中，仪器测量不准确也是误差的主要来源。任何光度计都有一定的测量误差）

2、75ml的菌，经18h左右的培养，后sorbital洗涤完毕后，50ml离心管里所剩菌体特别浓，需要1ml sorbitol才可溶解为糊状。正常培养的OD在1.2～1.5之间的500ml菌液，收集的感受态也用1ml稀释的，没那么粘稠。可以看看降低培养温度（27摄氏度）或缩短培养时间（12h）。

3、甚至不用转接,直接挑单克隆在50－100mlYPD中摇过夜，效果也很好

二、制备感受态的菌液量

如果只转一个样品，50ml就够了，一般50ml的培养液如果OD值正常的话够做10管感受态的，其他的按比例缩小。用大试管摇5ml菌液，然后取1ml毫升在1.5mlEP管中制感受态，每一步的离心时间30秒就行。整个流程时间短，制备好的感受态用来做转化的效率很高。

山梨醇离心，洗涤的过程之后的重悬的时候注意浓度，不要过于粘稠和稀释。

三、感受态的保存

感受态细胞做好后由于电转化杯还没有处理好等原因，在冰上放几个小时再做可能有一定的影响，尽量马上制备马上转化。如果感受态细胞要保存，不需要加甘油，一般80ul EP管分装，-70 或 -80 摄氏度保存。

另附：酵母GS115分离纯化

接种GS115于5ml YPD液体培养基，30℃，200rpm振荡过夜，涂布 YPD平板，30℃培养48 小时，用 YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板，4℃保存。

四、电转化注意点：

1、感受态做好后，后一次吸出sorbital时，不是直接倒调的，而是用毛细管轻吸出来的，这样可能使剩下的感受态纯净些。

2、后用毛细管取出100ul出来，加入质粒，混匀！（怕量不够，吸得很多，电转时效果反而不好）

3、电转杯清洁处理:一般先冲洗，洗净；然后浸泡在75%的乙醇中；使用前我们都是放在超净台上，开启紫外，边吹风晾干，边进行紫外照射。电转杯的新包装或重复使用可能对转化率有一定的影响。

4、电击的时候，电压数以及电击时间可以摸索一下，适当增加电压或者延长电击时间都可以。电击条件比如1.5kv，放电4.8～5.5ms。电击所有过程都要尽量在冰上进行，电击时间可以减少一点，设置为5ms左右，电击之后马上加入预冷的山梨醇溶液，转移至EP管，30度静止培养1h。如果菌体悬液浓度比较大的时候，在制备感受态的时候要留心一下操作中的问题了。

5、电击之后，加入1ml的山梨醇，吸入1.5ml的ep管中，置于30度摇床低速培养1h，再涂板。威尼德生物科技（北京）有限公司（www.bio-vleader.com），研发生产的双波全能型电穿孔仪Gene Pulser X2通过高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，从而吸收周围介质中的外源分子。这种技术将核苷酸、DNA与RNA、蛋白、糖类、染料以及病毒颗粒等导入原核和真核细胞内。电转化相对于其它物理和化学转化方法，是一种有价值和有效的替代方法。广泛用于植物、动物和微生物的各类细胞电穿孔。

6、注意的是处理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT单独于-20度保存，可配成100倍的贮备液。

7、转化后1ml用sorbitol重悬的细胞悬液不能全部涂在一块板子上，按标准程序制作的感受态一般3块左右可能比较合适，以干燥后看见一薄层淡淡的白色为宜。转化子会在白色的薄层上长出圆韵、饱满的大菌落的。

五、转化试剂和培养基的正确准备方法

1、MD板子提前几天做好，放在冰箱里，涂板的时候吸收效果会好些。如果是新板子，可能吸收不是太好，板子上有些积层，反而不利于生长。

2、YNB 42度水浴一会，然后过滤除菌，YNB是加到培养基里面的，去离子水pH偏低，建议直接用蒸馏水就可以（关系不是太大）。

3、山梨醇，以及无菌去离子水均是冰冻，存放在4度冰箱中

4、一般用10ug以上质粒用SalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，约20ul ddH2O重溶。转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。有人用LiCl和DTT处理细胞，转化效率很高，可以试试。建议你不要用胶回收kit，回收的DNA可能还有盐，导致电击时放电时间很短。

5个电转化方案

方法一：高 效

1.收集菌体

取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP管中，4℃、10000g 离心1min，弃上清，沉淀用无菌水(4℃)洗涤，同样条件下离心，弃上清。

2.菌体处理

加入1ml处理液，室温下放置20min。

处理液：

10mM LiAc

10mM DTT（二硫苏糖醇，常用还原剂，有抗氧化作用）

0.6M sorbitol

10mM TrisHCl(pH7.5)

3.离心，弃上清，加入1ml 1M sorbitol ，离心，弃上清，

4.用1M sorbitol洗涤二次，到体积约为80μl.（菌体太多可适当弃去部分）

5.加入10μl.经过BglⅡ酶切处理的工程质粒，混匀后转入 电击杯中，冰浴5min.

6.电转. 1.5kv，25μF，200Ω条件下进行电转。

7.电击后立刻加入1mL 1M sorbitol，吸出后于30℃培养2h。

8.取一定量涂平板(YPDS + Zeocin，涂布的量分别为100、200微升，剩余的经离心处理后全部涂在一个平板上)

有一点要注意的是处理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT单独于-20度保存，可配成100倍的贮备液。

方法二：按下面步骤转化,开始每个板子只长了一二十菌落;小细节修改后,每个板长了约100个.

步骤如下：

1、目的DNA（pPIC9K)，经电泳检测已经线性化（SalI酶切）；

2、DNA纯化方法是经酚仿－氯仿两步抽提后，无水乙醇沉淀的，目测定量应足够；

3、GS115甘油菌经新鲜平板复苏后，5ML培养过夜，16h左右后，取菌1：100稀释，接种于70ml菌液扩大培养，14h后测得OD600约1.3左右。

4、将sorbital、水和菌液均冰浴；

5、菌液离心5min－100ml冰水洗涤－50ml冰水洗涤－4ml sorbital洗涤，然后溶解于300ul冰sorbital；

6、加入约5～10ug的DNA，枪吹匀，置0.2CM电转杯静置5min；

7、电击，1,5KV.

8、立即加入1ml冰浴的sorbital，静止10min。威尼德生物科技（北京）有限公司（www.bio-vleader.com），研发生产的双波全能型电穿孔仪Gene Pulser X2通过高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，从而吸收周围介质中的外源分子。这种技术将核苷酸、DNA与RNA、蛋白、糖类、染料以及病毒颗粒等导入原核和真核细胞内。电转化相对于其它物理和化学转化方法，是一种有价值和有效的替代方法。广泛用于植物、动物和微生物的各类细胞电穿孔。

9、取100ul转化液，涂布10cm的MD平板。

做了一点修改每块板子大概能长100来个菌落（一般需要2天左右）：

1、菌液收集时间：以前可能是OD值测得不太准确，我然后把菌液分别做了1、2、4、8、16倍稀释，看其OD值是否呈线性关系。1、菌液测OD值时，建议将菌液稀释不同浓度测定，这样才准确些。菌液看上去浑浊，但OD值不高，很可能就是你的OD稀释倍数不够！你分别稀释2倍、4倍、8倍、10倍等，每个倍数做3－5个重复，应该可以大致推断OD值是否准确！

2、我开始是先挑单克隆于5mlYPD中，过夜16h后，转接于50ml YPD中，培养大概18个小时吧。OD值是否测准可以这样估算：OD600为40左右时，菌体湿重（6000rpm离心5min）约0.95g/10ml。高密度发酵时菌体湿重将相应下降。

3、电击条件等上面帖子上都有，1.5kv，放电4.8～5.5ms。

2、其它做法相同，就是感受态做好后，一次吸出sorbital时，不是直接倒调的，而是用毛细管轻吸出来的，这样可能使剩下的感受态纯净些。

3、用毛细管取出100ul出来，加入质粒，混匀！（我以前怕量不够，吸得很多，电转时效果反而不好。 ）

4、MD板子提前几天做好，放在冰箱里，涂板的时候吸收效果会好些。如果是新板子，可能吸收不是太好，板子上有些积层，反而不利于生长。

5、你说的YNB，我用的是成品，只需要直接配制。42度水浴一会，然后过滤除菌。我没有加硫酸铵。YNB是加到培养基里面的，去离子水pH偏低哦，我建议直接用蒸馏水就可以了（关系不是太大）。

方法三：简便独特

在筛选高表达菌种中，与大多数人和说明书有区别(成功做出几个基因):

每次转化前，均用多种酶BlgII/salI/sacI同时切，转化时，用GS115/KM71/KM71H同时转化，转化的条件也和大家一样，即1.5/25/200,但是我用的是0.1的杯子，不是0.2的，转化后涂MM及YPD+0.25G，长出菌落后，即进行大规模的表达试验，直接用YPD表达的，一般48h后即进行大量的SDS-PAGE鉴定，鉴定时，样品不用浓缩，直接上样，看到目的带后再做PCR，测序。

方法四：没有转化子（无aa的YNB和硫酸铵称好后，去离子水溶解，然后高压灭菌）

1.挑取酵母单菌落，接种至含有50ml YPD培养基的三角瓶中，30℃、250-300rpm培养过夜约14h，OD600约1.3

2.菌液离心5min－50ml冰水洗涤－25ml冰水洗涤－2ml sorbital洗涤，然后溶解于200ul冰sorbital；两管分装，每管100ul

3.加入约5～10ug的线性化的DNA20ul，枪吹匀，置0.2CM电转杯冰浴5min；

4.电击，1,5KV.使用的是 Eppendorf 2510，用于转化细菌及酵母。

5.立即加入1ml冰浴的sorbital，静止1h。

将菌体悬液涂布于MD平板上，每300µl涂布一块平板；

方法五: 和Invitrogen公司说明书差不多的方法

X33菌株于100ml YPD摇到OD600约1.1-1.3，太高影响感受态效率

(1) 1500－1700g离心5min，将离心管倒置在吸水纸上轻轻控几下，充分弃上清

(2) 加入100ml 冰浴的超纯水ddH2O，可在振荡器上振荡混匀，可静置3－5分钟

(3) 离心，弃上清，再加100ml ddH2O洗一遍

(4) 离心，弃上清，加20ml 冰浴1M Sorbitol洗一遍

(5) 离心，弃上清，菌体置于冰浴中，加入约100－200ul Sorbitol混匀

加入Sorbitol量需自己调整，这时菌液很浓，只要能够用200ul黄枪头吸出来就可以了，一般共有约400－500ul，够做几管感受态了。

(7) 吸取100－150ul感受态到线性化的DNA中，用枪头打匀或手指弹匀

静置5min，于2mm电转化杯中，电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400），一般放电时间在4.5-4.9ms之间，小于4说明你的DNA盐浓度太高

(9) 立即加入1ml Sorbitol，转入10ml 离心管，30度静置1小时，然后加入1ml YPD，30度，200rpm摇1小时，取50－200ul菌液涂100ul/ml YPDS板

(10) 一般转化效率可以达到：200个以上转化子每200ul菌液，足够筛选表达菌株了。

方法六:酵母感受态细胞的制备威尼德生物科技（北京）有限公司（www.bio-vleader.com），研发生产的双波全能型电穿孔仪Gene Pulser X2通过高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，从而吸收周围介质中的外源分子。这种技术将核苷酸、DNA与RNA、蛋白、糖类、染料以及病毒颗粒等导入原核和真核细胞内。电转化相对于其它物理和化学转化方法，是一种有价值和有效的替代方法。广泛用于植物、动物和微生物的各类细胞电穿孔。

⑴ 接种Pichia pastoris GS115于5 ml YPD液体培养基，30℃，250~300250 rpm ，过夜。

⑵ 取200µl的培养物接种至含有500ml新鲜培养基的三角摇瓶中，28~30℃、250~300r/min培养过夜，一般12小时左右。

⑶ 将细胞培养物于4℃，5000g离心5min，用500ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；

⑷ 按步骤3离心，用250ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；

⑸ 按步骤3离心，用20ml的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；

⑹ 按步骤3离心，用1ml的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为2ml；

⑺ NOTE：可将其分装为200µl一份的包装冷冻起来，但如果保存时间过长会影响其转化效率。

化学转化

毕氏酵母氯化锂转化法

试剂

1. 1M LiCl：用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释

2. 50% PEG3350 ：Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装

3. 2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存

注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用；

毕氏酵母的转化

1. 煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；

2. 将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；

3. 对于每一个转化，按以下顺序加入：

50% PEG3350 240ul

1M LiCl 36ul

2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul

5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul

4. 剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；

5. 30℃水浴孵育30min；

6. 42℃水浴热休克20～25min;

7. 6000～8000rpm离心收集酵母菌体；

8. 重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育；

9. 1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定（将表达菌株和对照菌株在固体培养基平板，30'c培养至转化子出现） 

毕氏酵母PEG1000转化法

试剂

缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene glycol

缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35

缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35

未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存

注：1. 缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存;

2. 将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行）;

待转化毕氏酵母的制备

1. 接种环接种Pachia pastoris于YPD平板，30℃培养2d;

2. 挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30℃振荡培养过夜；

3. 取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0.5～0.8；

4. 室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次；

5. 重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulDMSO，混合后迅速于液氮中冷冻，

6. -70℃保存

毕氏酵母的转化

1. 将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于冻结的酵母细胞中；加入担体DNA（40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA）以获得大转化率；

2. 37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次；

3. 取出离心管，加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀；

4. 30℃水浴孵育1h；

5. 室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中；

6. 离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中；

7. 将所有转化液铺于选择性平板，于30℃孵育3～4天后，鉴定；威尼德生物科技（北京）有限公司（www.bio-vleader.com），研发生产的双波全能型电穿孔仪Gene Pulser X2通过高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，从而吸收周围介质中的外源分子。这种技术将核苷酸、DNA与RNA、蛋白、糖类、染料以及病毒颗粒等导入原核和真核细胞内。电转化相对于其它物理和化学转化方法，是一种有价值和有效的替代方法。广泛用于植物、动物和微生物的各类细胞电穿孔。

毕赤酵母转化方法有4 种 。常用的是电转化法和原生质体法,其中电转化法方便,转化效率高,容易产生多拷贝整合。由于原生质体法须首先制备去除细胞壁的原生质体细胞以利于DNA 进入,然后细胞再生细胞壁,产生转化体,而ZeocinR 抑 制细胞壁的形成,导致不能产生转化体。因此利用ZeocinR 作为选择标记的载体如p PICZ 系列,不能使用原生质体法进行转化。