威尼德方波与指数波电穿孔仪：转化过程中蓝白斑筛选原理及问题总结

紫外交联仪   1 问题：做转化时，用蓝白斑筛选，以获得阳性克隆。那它和直接利用AMP抗性，而不用蓝白斑筛选，有什么区别吗？蓝白斑筛选有什么作用吗？

对于这一问题，我想，抗性筛选是防止杂菌生长。理论上说，当培养基中含有抗生素时，只有携带相应抗药性基因载体的细胞才能生存繁殖。蓝白筛选是验证是否有插入片断。两者结合起来，更有利于筛选到我们的目的菌。

威尼德生物科技（北京）有限公司（www.bio-vleader.com），研发生产的双波全能型电穿孔仪Gene Pulser X2通过高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，从而吸收周围介质中的外源分子。这种技术将核苷酸、DNA与RNA、蛋白、糖类、染料以及病毒颗粒等导入原核和真核细胞内。电转化相对于其它物理和化学转化方法，是一种有价值和有效的替代方法。广泛用于植物、动物和微生物的各类细胞电穿孔。

2 问题：如果加了AMP、IPTG和X-Gal，长出来的白斑一定都是含有插入片段的吗？有没有可能是载体自连的？

答：可以说，世界上没有绝 对的事情，即使加了AMP、IPTG和X-Gal，长出来的白斑也不一定都是含有插入片段的阳性克隆，具体原因可能有：

1）有可能是载体自连的假阳性；

2）作时AMP、IPTG和X-Gal其中一种或几种没涂均匀。

3）有时即使插入片段也会出现篮斑。只要编码框没被破坏。

3 问题：如何筛选重组菌落? 

答：可使用蓝/白斑筛选法，在涂布有IPTG和X-Gal的筛选平板上，重组菌株为白色，未转入重组质粒的菌株为蓝色。 

4 问题：蓝白斑筛选如何筛选合适的宿主菌株?

答：如进行蓝/白斑筛选，宿主菌β-半乳糖苷酶的α-肽编码区应在染色体或附加体上缺失掉（lacZΔΜ15）。TOP10和DH5α都能用于蓝/白斑筛选。 

5 问题：在蓝白斑筛选的过程中没有蓝斑是什么原因导致的？因为通过PCR检测插入片段的大小表明所挑的白斑克隆并没有插入片段。

答：原因很多，1）可能是你用的培养基含有乳糖或葡萄糖，因为半乳糖甘酶会分解乳糖，导致不能与X-Gal反应，葡萄糖不会诱导融合基因的表达。2）作时AMP、IPTG和X-Gal其中一种或几种没涂均匀。3）很多因素会造成PCR失败。

6 问题：我近期转化大肠杆菌时，通过蓝白斑筛选，挑出白色菌落做PCR，可是在电泳时发现在有目的带的同时还有比目的带小的杂带，不知为什么？我反复筛了几次，都是这样，可不可以摇菌提质粒？我应该下一步怎么做？

答：针对这样的情况，我觉得，你首先做酶切鉴定，看看你的目的片段是否真 正插入。其次，你应该检测PCR过程有没有问题。

7 问题：我用Amp-IPTG-X-gal LB平板进行蓝白斑筛选重组子，为何筛出的全是白斑，没一个蓝斑，挑几个白斑摇菌扩增后PCR检测也全是阳性克隆，不会全都重组成功了吧？什么原因呢？

答：这样的情况是完全有可能的，只要载体处理的好，应该说是有这种可能。