脉冲长度

脉冲长度是样品暴露于脉冲的持续时间。这是以微秒到毫秒范围内的时间来度量的。调整此参数取决于脉冲波形。方波系统中的脉冲长度可以直接输入。指数衰减波系统中的脉冲长度称为“时间常数”，其特征为脉冲能量（e）或电压衰减至原始设定电压三分之一的速率。该时间常数通过调整指数衰减波形中的电阻和电容（RC）值进行修改。时间常数计算T=RC，其中T为时间，R为电阻，C为电容。脉冲长度与场强间接作用，以增加孔隙形成，从而增加目标分子的吸收。通常，在参数优化过程中，电压增加后，脉冲长度应逐渐减小。降低电压时，情况正好相反。脉冲长度是一个与电压密切相关的关键变量，在优化电气参数以使给定电池类型的结果大化时，需要考虑脉冲长度。威尼德生物科技（北京）有限公司（www.bio-vleader.com），研发生产的双波全能型电穿孔仪Gene Pulser X2通过高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，从而吸收周围介质中的外源分子。这种技术将核苷酸、DNA与RNA、蛋白、糖类、染料以及病毒颗粒等导入原核和真核细胞内。电转化相对于其它物理和化学转化方法，是一种有价值和有效的替代方法。广泛用于植物、动物和微生物的各类细胞电穿孔。

脉冲数

对于大多数细胞类型而言，电穿孔通常作为单个脉冲进行。然而，其他细胞系可能需要多次脉冲才能达到大转染效率。当施加多个脉冲以逐渐渗透细胞膜时，通常使用较低的电压。这允许分子转移，同时避免损坏精细或整个组织样本。这种多次脉冲的方法对于大限度地传递基因而不会对体内、子宫和外植体组织环境造成组织损伤至关重要。使用多脉冲需要优化关键电气参数，包括电压和脉冲长度。通常，对于体内应用在10-100伏之间的较低电压和30-50毫秒范围内的脉冲长度提供了有效的转染。电压、脉冲长度和脉冲数将根据转染的细胞类型和分子（DNA或RNA）而变化。

电穿孔缓冲液

用于电穿孔的缓冲液可能因细胞类型而异。许多应用使用高传导性缓冲液，如PBS（磷酸盐缓冲盐水<30欧姆）和HBSS（Hepes缓冲液<30欧姆）或可能含有血清的标准培养基。其他推荐的缓冲液是低渗透缓冲液，其中细胞在脉冲前不久吸收水分。这种肿胀这些电池可降低渗透电压，同时确保膜对许多电池更容易渗透，但可能对其他电池造成损害。细菌等原核细胞需要使用高电阻缓冲液（>3000欧姆）。因此，细胞的适当制备和清洗至关重要去除多余的盐离子以减少电弧发生的机会。电穿孔缓冲液的离子强度直接影响样品的电阻，进而影响脉冲长度或脉冲时间常数。反应杯中液体的体积对离子溶液的样品电阻有显著影响；这个样品的电阻与溶液体积和pH值成反比。随着体积的增加，电阻减小，这增加了电弧发生的可能性，降低了温度

体积会增加电阻并降低电弧电位。

DNA/RNA浓度

电穿孔通常被认为是一种将核酸（DNA、mRNA、siRNA和miRNA）转移到原核细胞和真核细胞的方法。电穿孔不只限于核酸传递，它还可以引入蛋白质、抗体、小分子和荧光染料。对于大多数细胞类型，用于转染的DNA标准范围为5–20µg/ml；然而，在某些情况下，将DNA浓度提高至50µg/ml可在不改变其他参数的情况下提高转染效率。通过DNA滴定确定DNA浓度可能是有益的。分子的大小将对用于转染细胞的电参数产生影响。小分子（siRNA或miRNA）可能需要更高的电压，脉冲长度为微秒，并且大分子（DNA）可能需要更低的电压和更长的脉冲长度。EDTA或Tris等缓冲液可显著降低转染效率。因此，我们建议在蒸馏水中提取DNA。将连接混合物电穿孔到大肠杆菌中会导致电弧和转化减少。用diH2O、透析或稀释至少1:5的连接混合物乙醇沉淀可以显著提高转化率效率并降低电弧放电的可能性。

电穿孔仪