1． 电穿孔前一至两天，将细胞转移至装有新鲜培养基的培养皿中，保证实验当天细胞量达到70-90％。

2． 加培养基（不含抗生素）到24孔板中，每孔500µl，放于37℃培养箱预热。（注：使用其他孔数培养板或者100µl枪头时，加入培养基和质粒及细胞的数量见下表1）威尼德生物科技（北京）有限公司（www.bio-vleader.com），研发生产的双波全能型电穿孔仪Gene Pulser X2通过高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，从而吸收周围介质中的外源分子。这种技术将核苷酸、DNA与RNA、蛋白、糖类、染料以及病毒颗粒等导入原核和真核细胞内。电转化相对于其它物理和化学转化方法，是一种有价值和有效的替代方法。广泛用于植物、动物和微生物的各类细胞电穿孔。

3． 将培养细胞取出，悬浮细胞直接取部分培养的细胞计数，确定细胞密度；贴壁细胞用2ml的PBS冲洗细胞，吸出PBS，加入约750µl胰酶消化3min，加入750µl培养基，终止消化，取部分细胞悬液进行细胞计数，确定细胞密度。

4． 将悬浮细胞转到离心管，室温下100-400g离心力离心5min，倒掉上清。

5． 向细胞中加入2mlPBS冲洗细胞，室温下100-400g离心力离心5min。

6． 吸出PBS,用重悬缓冲液R重新悬浮细胞沉淀，使细胞密度为2.0×107个/ml。轻轻吹打细胞，使其形成单细胞悬液。（注：细胞悬液在室温时间不能超过15-30min,否则将导致细胞活性和转染效率降低）

7． 将适量质粒加到1.5ml离心管中，再加入细胞悬液，轻轻混匀。所用细胞浓度、DNA和接种体积见下表1）。

8． 将装有电解缓冲液装入电转杯中。

9． 在仪器上设置脉冲电压、脉冲宽度、脉冲数。

10．用10µl的枪头吸细胞混合液，枪头中须无气泡。

11．选择电穿孔方案，并按下触摸屏上的Start（开始）键。

12．电脉冲释放后，触摸屏上会显示完成，提示电穿孔完成以及脉冲时间。

13．将脉冲好的样品立即转移至准备好的装有预热培养基的培养板中。将培养板放到培养箱

培养。

14．实验结束后，倒掉移液器中E液，关闭电转仪。

15 正常培养4h，待细胞贴壁后，给细胞换新鲜的完全培养基，以去除上层的死细胞；

16 培养24h后，即可进行细胞转染效率的检测或是进行细胞实验处理。